引物設計總結word

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1、引物設計總結寡核苷酸的優(yōu)化設計鄭仲承(中國科學院上海生命科學院生物化學和細胞生物學研究所，上海200031)在核酸分子雜交、DNA序列測定和通過PCR放大DNA片段等實驗中，都需要使用寡核苷酸作為探針或引物，而對這些反應的質量起最重要影響作用的，就是這些寡核苷酸探針或引物。用優(yōu)化的寡核苷酸進行實驗能夠很快得到好的結果，而用不夠合適的寡核苷酸時，常常得出似是而非的結果，不僅大大增加了后續(xù)實驗的工作量，還可能一無所獲。怎樣優(yōu)化設計寡核苷酸呢?至少有下列幾個方面的問題需要考慮。1.估測可能形成的DNA或RNA雙鏈的穩(wěn)定性

2、寡核苷酸，無論是DNA的或者RNA的，都有形成雙鏈結構的潛在可能性，正如下面反復提到的，這種結構對寡核苷酸的作用有很大影響。所以，預測這種結構的穩(wěn)定性對設計和優(yōu)化寡核苷酸就很重要。在一個雙鏈結構中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的。在熱動力學中，這樣的性質以雙鏈形成時的自由能(ΔG)來表示?，F(xiàn)在，大多采用Breslauer等人提出的，以最接近的相鄰核苷酸的動力學數(shù)值(自由能)來預測雙鏈穩(wěn)定性的方法。為簡化起見，所有的計算都在25℃條件下進行。此時，最接近的相鄰核苷酸的自由能是：此主題相關圖片如下：ΔG(kca

3、l/mol)例如，雙鏈d(ACGG／CCGT)的ΔG是：ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0kcal/mol此計算方法特別適用于測定其3′末端會形成雙鏈的引物的相容性。也可以用來計算發(fā)夾環(huán)結構的ΔG。不過，這時需要根據(jù)環(huán)區(qū)內(nèi)核苷酸的數(shù)量添加一定的數(shù)值。如3個核苷酸時為5.2kcal/mol；4個時為4.5；5個為4.4；6個是4.3；7和8個為4.1kcal／mo1。2.選擇引物的一般規(guī)則設計和選擇引物時有5個要素必需注意。2.1引物的3′末端不互補引物

4、的3′末端一定不能有很大的互補性，因為它們的互補會形成引物二聚體，這就會帶來很大的問題，例如合成出非專一的產(chǎn)物，極大地減少所期望產(chǎn)物的得量。有實驗表明，3′末端雙鏈的ΔG是0～－2kcal/mol時，PCR產(chǎn)量幾乎達到百分之百，隨著其絕對值的增加產(chǎn)量逐漸下降，在－6時只有40%，到－8時少于20%，而－10時，接近于0。雖然產(chǎn)量還取決于其他參數(shù)，如退火溫度、引物的專一性等等，但是用Taq聚合酶操作時，由于它的工作能力很強，能夠在很短的時間內(nèi)就識別3′末端互補的雙鏈區(qū)并發(fā)動聚合反應，即使3′末端雙鏈的穩(wěn)定性很差也不能

5、阻礙它的作用，所以這時產(chǎn)量對二聚體的形成就有很大的依賴性。2.2引物分子內(nèi)不互補應當盡量不用會通過釋放能量而形成分子內(nèi)雙鏈結構的寡核苷酸。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3kcal/mol的自身互補引物也可以得到不錯的結果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時就很麻煩，即會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應，減少了參與正式反應引物的數(shù)量。當然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對反應就沒有多大的影響了。2.3引物的組分、解鏈溫度和長度11普遍認為PCR引物應當有50%的GC/AT比率。其實，這是不對的。以人基因組DNA為模板，用81%AT的引物

6、可以產(chǎn)生單一的，專一的，長250bp，含有70%AT的產(chǎn)物。完全沒有必要復雜地去計算產(chǎn)物和引物的解鏈溫度，PCR引物的GC/AT比率應當?shù)扔诨蚋哂谒糯蟮哪０宓腉C/AT比。要知道，更重要的因素是模板與穩(wěn)定性較小的引物之間解鏈溫度的差異。差異越小，PCR的效率越高。因為DNA的解鏈溫度也取決于它的長度，所以有的研究者喜歡設計很長，而不求它很穩(wěn)定的引物。可是，引物太長就難以避免形成二聚體和自身互補，因此，一般還是不用為好。如果期待的產(chǎn)物長度等于或小于500bp，選用短的(16～18mer)的引物：若產(chǎn)物長5kb，則

7、用24mer的引物。有人用20～23mer引物得到40kb的產(chǎn)物。但是，引物較長時，如果不借助引物選擇的計算機軟件幫助，就很難確定一對引物是否會形成二聚體，是否有自身互補性以及專一性如何。于是，用眼睛選出來的寡核苷酸放大長片段DNA時就會使引物彼此引發(fā)而不是延伸模板，得出非專一產(chǎn)物。通過下述的觀察內(nèi)部穩(wěn)定性原理可以極大地減少這種問題。2.4引物的內(nèi)部穩(wěn)定性在DNA測序和PCR中最好用5′末端穩(wěn)定(如GC含量較多)，而3′末端不太穩(wěn)定(如AT含量較多)的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發(fā)反應。這就是基于引物內(nèi)部

8、穩(wěn)定性的經(jīng)驗之談。其3′末端穩(wěn)定性低的引物在這些反應中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的堿基與非靶位點堿基所形成的配對的穩(wěn)定程度還不足以引發(fā)DNA合成，所以不會產(chǎn)生假產(chǎn)物。因此，為了有效地引發(fā)反應，引物的5′末端和中央部分必須與靶DNA也形成雙鏈。與此相反，帶有穩(wěn)定的、GC豐富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都與靶序列配對，只憑借其3′末