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《《簡并引物設(shè)計》word版》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、簡并引物設(shè)計的方法簡并引物是指用來編碼一段短肽序列的不同堿基序列的混合物。主要用來同源克隆未知的基因，或用來分析某一種基因多態(tài)性的一種方法。簡并引物設(shè)計的常見程序如下：1.利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列。因為密碼子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白)，在整個Nr數(shù)據(jù)庫中中查找與之相似的氨基酸序列。2.對所找到的序列進行多序列比對。將搜索到的同一基
2、因的不同氨基酸序列進行多序列比對，最好采用局部比對程序如BLOCK，網(wǎng)址：http://bioinformatics.weizmann.a...ww/make_blocks.html。也可選工具有ClustalW。3.確定合適的保守區(qū)域。設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50～400個氨基酸為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有4個氨基酸。若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到4個氨基酸的保守區(qū)域，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求
3、，則需進行三次比對。總之，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次比對的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是至少有兩個4個氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。4.利用軟件設(shè)計引物。當?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計引物了，如利用primer5.0進行設(shè)計。但最好使用專門的簡并引物設(shè)計的方法如：CODEHOP（網(wǎng)址：http://bioinformatics.weizmann.ac.il/blocks/codehop.html），GeneFisher2（網(wǎng)址：http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genef
4、isher2/）。在這里我們特別值得說明的是CODEHOP方法，該方法要求的保守區(qū)較短，而且能有效的降低引物的兼并度，是一種非常有效的方法。該方法主要是通過將簡并區(qū)放在3′末端，并在5′端設(shè)計一個一致性的區(qū)域來降低兼并度，詳見http://www.helixnet.cn/thread-8194-1-1.html。5.對引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，則其簡并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡并度太高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N（因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對）和
5、根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度（有個查密碼子偏好的數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：http://www.helixnet.cn/viewthrea...ht=%C3%DC%C2%EB%D7%D3）。注意：該方法設(shè)計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。引物中符號說明：A代表AC代表CG代表GT代表TM代表AorCR代表AorGW代表AorTS代表CorGY代表CorTK代表GorTV代表AorCorGH代表AorCorTD代表AorGorTB代表CorGorTN代表GorAorTorC簡并引物設(shè)計過程（1
6、）利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質(zhì)或cDNA編碼的氨基酸序列因為密碼子的關(guān)系，不同的核苷酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP（通過蛋白查蛋白），在整個NR數(shù)據(jù)庫中查找與之相似的氨基酸序列。（2）對所有的序列進行多序列比對將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，可選工具有ClustalW/X,也可在線分析。所有序列的共有部分將會顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。（3）確定合適的保守區(qū)域設(shè)
7、計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50~400個氨基酸殘基為宜，使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個氨基酸的保守區(qū)，因為每條引物至少18bp左右。若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到6個氨基酸序列的保守區(qū)，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣關(guān)系近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對，總之，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個6個氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。（4）利用軟件設(shè)計引物當?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件
8、來設(shè)計引物了，其中Primer5.0支持簡并引物的設(shè)計，將參與多序列比對的序列中的任一條導(dǎo)入Primer5.0中，將其翻譯成核苷酸序列，該序列群可用一條有簡并性的核
