簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則

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1、ThecentralroleofUDPGDHplayedincapsuleandotherpolysaccharidessynthesis.KPS,capsulepolysaccharide;LPS,lipopolysaccharide簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法（1）利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質(zhì)或cDNA編碼的氨基酸序列因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核苷酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP（通過(guò)蛋白查蛋白），在整個(gè)NR數(shù)據(jù)庫(kù)中查找與之相似的氨基酸序列。?（

2、2）對(duì)所有的序列進(jìn)行多序列比對(duì)將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有ClustalW/X，也可在線分析。所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來(lái)?！?”表示保守，“：”表示次保守。?（3）確定合適的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50~400個(gè)氨基酸殘基為宜，使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)氨基酸的保守區(qū)，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)氨基酸序列的保守區(qū)，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣關(guān)系近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次

3、比對(duì)，總之，究竟要選多少序列來(lái)比對(duì)，要根據(jù)前一次的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。?（4）利用軟件設(shè)計(jì)引物當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物了，其中Primer5.0支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)，將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入Primer5.0中，將其翻譯成核苷酸序列，該序列群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在Prim

4、er5.0中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。?（5）對(duì)引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則簡(jiǎn)并度=4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度很高不利于PCR，可以通過(guò)次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤可以很好的和4種堿基配對(duì)）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來(lái)降低簡(jiǎn)并度。?這樣設(shè)計(jì)出來(lái)的簡(jiǎn)并引物對(duì)，適用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。?簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則?從蛋白到核酸，請(qǐng)注意：?（1）盡量選擇簡(jiǎn)并度低的氨基酸區(qū)

5、域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)，如蛋氨酸和色氨酸僅有一個(gè)密碼子。?（2）充分注意物種對(duì)密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡(jiǎn)并性。?（3）引物不要終止于簡(jiǎn)并堿基，對(duì)大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō)，意味著引物的3末端不要位于密碼子的第三位。?（4）在簡(jiǎn)并度低的位置，可用次黃嘌呤（dI）代替簡(jiǎn)并堿基。?以上幾點(diǎn)遵循的總的原則為：盡量降低引物的簡(jiǎn)并度，尤其在3'末端或近3'末端。