實例圖解簡并引物設計內容.pdf

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1、2013-10-27實例圖解簡并引物設計（By?Raindy）?【絮語】設計一對合適的引物是PCR擴增目的基因成功的關鍵，但許多人往往過度依賴PrimerPremier（以下簡稱PP）或Oligo等引物設計軟件，有時候引物沒設計成，卻身陷軟件之中無法自拔。其實，不論特異性引物或簡并引物，只要掌握了幾個關鍵點，手動也可以設計出一對好引物。如果不是大批量設計引物或設計復雜的引物序列，下面的四個常用工具即可輕松勝任引物設計任務。下文以馬鈴薯Y病毒CP基因簡并引物設計為示例，分享一些個人經驗，希望對初學者能起個拋

2、磚引玉作用。受專業(yè)領域及水平所限，文中有不當之處，敬請各位同仁、童鞋批評指正?！鞠嚓P工具】（1）MEGA5-多重序列比對、選取基因區(qū)域、序列編輯（2）DNAMAN8-檢測兩引物的互補性（3）OligoCalc-評估引物的屬性（4）WebLogo3-直觀顯示簡并堿基-------------------------------------------------【華麗分割線】-------------------------------------------------【基本原則】設計一對好的引物，歸結起

3、來就是5′端引物、3′端引物之間以及兩者與模板的關系處理得恰到好處：（1）兩引物的序列要與模板的序列緊密互補；（2）兩引物不能在模板的非目的位點發(fā)生錯配；（3）兩引物之間盡量減少二聚體或發(fā)夾結構生成?！狙由煸瓌t】（1）引物長度：常用為18-27bp，最大不可超過38bp，否則容易導致延伸溫度過高，不適合DNA聚合酶反應；（2）GC含量：一般介于40%-60%之間，且兩個引物之間的GC含量相差不能過于懸殊；（3）堿基分布：隨機分布最佳，但避免連續(xù)的GC，GC富集區(qū)容易導致錯誤引發(fā)反應?！咎貏e注意】5′端引物

4、的作用主要限定PCR產物的長度，對擴增特異性影響不大；引物的延伸是從3′端開始的，所以3′端引物是影響特異性擴增的最關鍵因素，因此，在實際設計過程中，設計3′端引物時，需要綜合考慮以下幾個內容：??（1）不要終止于密碼子的第3位??（2）末位堿基避免使用堿基A??（3）避免出現(xiàn)3個以上連續(xù)的G或C，如GCG或CCC或GGG??（4）ΔG的絕對值不可超過9??（5）與非特異擴增的序列同源性不能超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源??（6）不能進行任何修飾----------------------------

5、-----------【華麗分割線】-------------------------------------------------【設計流程】【示例背景】馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）是侵染馬鈴薯、煙草、辣椒等茄科作物并造成嚴重危害的病毒之一，廣泛分布全球各馬鈴薯種植區(qū)。RT-PCR技術具有高度的特異性和靈敏性等特點，已經成為PVY檢測最常見的方法。但由于PVY株系分化嚴重，不斷有新的重組株系產生，單一的特異性引物無法適應PVY不同株系的檢測需求，需要設計一對簡并引物以能夠滿足生產上

6、的檢測需求?！驹敿殘D解】1.序列準備：（1）GenBank下載PVY全基因組序列（2）由于基因序列比較大，且數(shù)量多，推薦用MAFFT多重序列比對（3）擴增片段區(qū)域選擇，CP基因長度及位置如下圖所示：先將光標定位在第一條序列任意位置，然后在左下角"Site"處直接輸入CP基因上游分界點位置（8391）后回車。接著點擊“Speicaes/Abbrv”和8391那一列的交界點時按下鍵盤上“Shift”不放，移動光標到“1”那一列，此時點擊鼠標右鍵“Delete”刪除冗余序列。裁切后得到CP基因編碼區(qū)序列，“Ex

7、portAlignment”導出CP基因序列（推薦fasta格式）。2.引物設計推薦先設計3′端引物，至于原因，上面的【特別注意】中已提到，這里不再贅述。（1）選擇引物序列綜合考慮引物設計原則及特別注意，在CP基因3'端位置選取一段合適的序列（784-803bp），804bp位置為A且是第三個密碼子位置，所以棄去末位的A堿基。-------------------------------------------------------------------------------------------

8、--------PS：是否位于密碼子的第3位，可以通過“TranlatedProteinSequences”-“DNAsequences”切換查看，如下圖，CP基因的末端3個堿基是終止密碼子所在的位置，A是第三位密碼子。---------------------------------------------------------------------------------------------------（2）生成S