簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)方法(實(shí)際操作步驟)

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1、自己做過(guò)一些簡(jiǎn)并引物，現(xiàn)將我利用生物信息學(xué)資源設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的各個(gè)步驟作一個(gè)總結(jié)，各位戰(zhàn)友可將各自的心得體會(huì)寫下，以便大家交流?。?！一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過(guò)蛋白查蛋白)，在整個(gè)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中中查找與之相似的氨基酸序列。二、對(duì)所找到的序列進(jìn)行多序列比對(duì)將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，可選工具有ClustalW，也可

2、在線分析[url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。其結(jié)果入下圖所示,所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來(lái)。“*”表示保守，“：”表示次保守。三、確定合適的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域，且兩個(gè)保守區(qū)域相距50～400個(gè)aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)aa殘基，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)aa的保守區(qū)域，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)?？傊烤挂x多

3、少序列來(lái)比對(duì)，要根據(jù)前一次比對(duì)的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個(gè)6個(gè)aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。四、利用軟件設(shè)計(jì)引物當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來(lái)設(shè)計(jì)引物了，其中pp5支持簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)（關(guān)于其的使用請(qǐng)見(jiàn)筆者的另一個(gè)帖子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡(jiǎn)并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個(gè)核苷酸的序列群，該群可用一條有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈來(lái)表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S

4、＝C／G，W＝A／T，H＝A／C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G/T,N=A／C／G/T），該具有簡(jiǎn)并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡(jiǎn)并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。五、對(duì)引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則其簡(jiǎn)并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡(jiǎn)并度多高不利于pcr。我們可以通過(guò)用次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤能很好的和4種堿基配對(duì)）和根據(jù)物種密碼子偏好

5、這兩種方法來(lái)降低簡(jiǎn)并度（有個(gè)查密碼子偏好的數(shù)據(jù)庫(kù)我以前發(fā)過(guò)大家搜索一下把）。最后，這樣子設(shè)計(jì)出來(lái)簡(jiǎn)并引物對(duì)，適用于用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。PCR引物設(shè)計(jì)的11條黃金法則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。引物長(zhǎng)度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸

6、溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。4.引物3′端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3

7、′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。6.堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤