簡并引物設(shè)計方法(實際操作步驟)

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1、自己做過一些簡并引物，現(xiàn)將我利用生物信息學(xué)資源設(shè)計簡并引物的各個步驟作一個總結(jié)，各位戰(zhàn)友可將各自的心得體會寫下，以便大家交流！！！一、利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列因為密碼子的關(guān)系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTp(通過蛋白查蛋白)，在整個Nr數(shù)據(jù)庫中中查找與之相似的氨基酸序列。二、對所找到的序列進行多序列比對將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，可選工具有ClustalW，也可在線分析[

2、url][/url]http://www.ebi.ac.uk/clustalw/。其結(jié)果入下圖所示,所有序列的共有部分將會顯示出來?！?”表示保守，“：”表示次保守。三、確定合適的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域，且兩個保守區(qū)域相距50～400個aa為宜，使得pcr產(chǎn)物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到6個aa的保守區(qū)域，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣相近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對。總之，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)

3、前一次比對的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。最終目的就是有兩個6個aa且兩者間距離合適的保守區(qū)域。四、利用軟件設(shè)計引物當?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計引物了，其中pp5支持簡并引物的設(shè)計（關(guān)于其的使用請見筆者的另一個帖子http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=8798113&sty=1），將參與多序列比對的序列中的任一條導(dǎo)入pp5中，再將其翻譯成核苷酸序列，有密碼子簡并性，其結(jié)果是有n多條彼此只相差以個核苷酸的序列群，該群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝A／T，H＝A／

4、C／T，B＝C／G／T，V＝A／C／G，D＝A/G/T,N=A／C／G/T），該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對應(yīng)部分，在pp5中修改參數(shù)，令其在兩個距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會有數(shù)對，分數(shù)越高越好。五、對引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則其簡并度＝4×2×4×3×4×3×2=2304，很明顯該條引物的簡并度多高不利于pcr。我們可以通過用次黃嘌呤代替N（因為次黃嘌呤能很好的和4種堿基配對）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度（有個查密碼子偏好

5、的數(shù)據(jù)庫我以前發(fā)過大家搜索一下把）。最后，這樣子設(shè)計出來簡并引物對，適用于用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。PCR引物設(shè)計的11條黃金法則1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。2.引物長度一般在15~30堿基之間。引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)。

6、3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。GC含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。4.引物3′端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會

7、影響擴增的特異性與效率。5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。6.堿基要隨機分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤