靶向抑制人木糖基轉(zhuǎn)移酶ⅰ基因的shrna真核表達載體的構(gòu)建

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1、萬方數(shù)據(jù)華西口腔醫(yī)學雜志第26卷第2期2008年4月WestChinaJournalofStomatologyV01．26No．2Apr．2008【文章編號】1000—1182(2008)02-0206-05靶向抑制人木糖基轉(zhuǎn)移酶一I基因EtCJshRNA真核表達載體的構(gòu)建石宏，王潔，王旭，顧洪濤，侯亞麗，于利潔(河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院病理科，河北石家莊050017)【摘要】目的構(gòu)建靶向抑制人木糖基轉(zhuǎn)移酶一I(XT—I)基因的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)真核表達載體，為探討唾液腺腫瘤性肌上皮細胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基礎。方法根據(jù)GenBank提供的XT—I基因序列，設計

2、短鏈寡核苷酸，化學合成后經(jīng)退火形成雙鏈DNA片段，克隆至lJPgenesil一1載體中，構(gòu)建shRNA真核表達載體WJl一WJ6，行酶切及核酸測序鑒定；將構(gòu)建的x’r-I特異性shRNA表達載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人唾液腺腺樣囊性癌細胞株ACC—M，在熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染效率，并采用半定量RT—PCR和Westernblot分別檢測轉(zhuǎn)染后細胞XT—I基因mRNA和蛋白表達水平的變化。結(jié)果經(jīng)酶切、連接后構(gòu)建的6個質(zhì)粒命名為WJl、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸測序鑒定證實，構(gòu)建的shRNA表達載體WJl一WJ6序列正確；轉(zhuǎn)染W(wǎng)Jl一W

3、J6后ACC—M細胞均可表達綠色熒光；流式細胞術測定轉(zhuǎn)染效率平均為50．26％；RT—PCR結(jié)果顯示，WJ3顯著抑gljXT-ImRNA的表達，抑制率為72．39％；Westernblot結(jié)果顯示，WJ3有效抑制xT—I的蛋白表達，抑制率為70．18％。結(jié)論成功構(gòu)建靶向抑制XT—I的shRNA真核表達載體WJl一WJ6，其中WJ3可高效抑制XT—I基因mRNA及蛋白水平的表達，為唾液腺腫瘤中PG的RNAi研究奠定了基礎。【關鍵詞】人木糖基轉(zhuǎn)移酶一I；短發(fā)夾狀shRNA；唾液腺腫瘤；肌上皮細胞；蛋白多糖【中圖分類號】R739．87【文獻標識碼】AConstructionofeukary

4、oticexpressionvectorofshorthairpinRNAtargetinghumanxyiosyltransferase-IgeneSHIHong,WANG№，WANGXu,GUHong-tao,HOUYa-li,YULij論、(Dept．ofOralPathology,CollegeofStomatology,HebeiMedicalUniversity,Sh擴iazhuang050017，China)[Abstract]ObjectiveTodesignandconstructtheplasmidsexpressingshorthairpinRNA(shRNA)

5、targetinghumanxylosyltransferase-Io【’r-I)whichistheinitiatingenzymeinthebiosynthesisofproteoglycans(PG)．MethodsShortchainoligonucleotidesweredesignedaccordingtothesequenceofXT—IprovidedbyGenBank．TheDNAsegmentsweregainedthroughannealingafterchemosynthesis．a(chǎn)ndwereclonedintoPgenesil-1vector．Therec

6、ombinantXT—IshRNAexpressionvectorswereidentifiedbydigestionandsequencinganalysis．AtlasttheconstructedXT—Iex-pressionvectorsweretransfectedintosalivaryadenoidcysticcarcinomacellline(ACC—M)byLipofectomineTM2000．Theexpressionofgreenfluorescentprotein(GFP)Wasdetectedbyinvertedfluorescentmicroscopea

7、ndtheratesoftransfectionwelt七detectedbyflowcytometer．SemiquantitativeRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofmRNAlevelofXT—IintransfectedACC—McellsandtheproteinexpressionofXT—IWS．8detectedbyWesternblot．ResultsTheplasmidsexpressingshRN