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《乙酰肝素酶shrna雙基因共表達真核載體的構(gòu)建和篩選 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、乙酰肝素酶shRNA雙基因共表達真核載體的構(gòu)建和篩選劉玉，辛?xí)匝?，毛敬，張濰【關(guān)鍵詞】乙酰肝素酶ConstructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene 【Abstract】AIM:ToconstructandidentifyeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene(HpashRNA).
2、METHODS:Sixpairsofoligonucleotidesicallysynthesized.AfterrandomlyconnectinganoligonucleotideandanotheroneidpGenesil1oterandterminationcode,themongreenfluorescenceprotein(EGFP)geneandNeogene.Inthisetryandfluorescencemicroscope.TheinhibitioneffectivenessofHpaproteinmunohistochemicalsta
3、ining.RESULTS:TheconstructedeukaryoticexpressionvectorseffectivelysuppressedtheHpaexpressionintransfectedcells.The3vectorsofdifferentshorthairpinRNAofHpaeffectivelysuppressedtheexpressioninSKOV3（P0.01）.CONCLUSION:ETAFECTENE轉(zhuǎn)染試劑（德國Biontex公司）；dsDNA片段（武漢晶賽生物工程公司化學(xué)合成）；山羊抗人Hpa多克隆抗體（SantaC
4、ruz公司）；SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色劑（棕色）（武漢博士德公司）. 1.2方法 1.2.1發(fā)卡樣Hpa基因（HpashRNA）設(shè)計根據(jù)GenBank提供的Hpa基因cDNA序列,通過基因Blast驗證,挑選6條長各為21個堿基的特異性寡核苷酸序列5＇GTACTTGCGGTTACCCTAT３＇;5＇GCTTCGTACCTTGGCCAGA３＇;5＇TTGCTACTCCGAGAACACT３＇;5＇TGGGTCGCAGTTAGGAGAA３＇;5＇GGAAGCTTCGAGTATACCT３＇;5＇GCTTCGAGTATACCTTCAT３＇.分別在5＇和3＇端
5、引入BamHI和HindIII酶切位點,按如下結(jié)構(gòu)BamHI+Sense+Loop+Antisense+終止信號+SacI/EcoRI/SacI/SalI/SalI/XbaI+HindIII化學(xué)合成有發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的shRNA寡核苷酸單鏈,同時合成互補鏈.1.2.2pGenesil1HpashRNA的構(gòu)建用50μLannealingbuffer溶解上述單鏈目的基因片段.各取2μL單鏈+16μLannealingbuffer，94℃退火自然冷卻至室溫.用雙鏈退火連接后再磷酸化的退火片段分別與線性化Pgenesil1載體連接，22℃水浴反應(yīng)過夜,構(gòu)建的陽性克隆命名為pG
6、enesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）,pGenesil1HpashRNA（3）. 1.2.3pGenesil1HpashRNA擴增及純化各取5μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5а，涂布于含Kanar抗性的LB平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜.各挑取3個單克隆菌落接種于3mL含Kanar抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜.收集菌液,小量快速抽提質(zhì)粒DNA,15g/L瓊脂糖凝膠電泳，部分菌液送上海申友公司測序. 1.2.4細胞轉(zhuǎn)染及表達鑒定提取3種重組質(zhì)粒，并進行DNA定量.SKOV3細胞生長到占瓶底約80%～90
7、%時，分為pGenesil1HpashRNA（1）,pGenesil1HpashRNA（2）,pGenesil1HpashRNA（3）及非特異性shRNA片段對照4組，按照METAFECTENE轉(zhuǎn)染試劑盒操作方法轉(zhuǎn)染，以含800mg/LG418的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4,接收光為530nm.用Cellquest軟件進行數(shù)據(jù)獲取與分析. 1.2.6免疫組化染色檢驗細胞Hpa蛋白表達細胞爬片，乙醇固定，按SABC方法染色.胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每張切片在400倍顯微鏡下隨機計數(shù)300個細胞.陰性（－）：不著色；陽性（+）：細胞質(zhì)內(nèi)有細小稀疏黃色顆粒；（）
8、：細胞質(zhì)內(nèi)有較密的細小黃
