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1、乙酰肝素酶shRNA雙基因共表達(dá)真核載體的構(gòu)建和篩選論文劉玉，辛?xí)匝?，毛敬，張濰【關(guān)鍵詞】乙酰肝素酶ConstructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene【Abstract】AIM:ToconstructandidentifyeukaryoticexpressionvectorexpressingdoubleshRNAsectionstargetingheparanasegene(HpashRNA).METHODS:
2、Sixpairsofoligonucleotidesicallysynthesized.AfterrandomlyconnectinganoligonucleotideandanotheroneidpGenesil1oterandterminationcode,themongreenfluorescenceprotein(EGFP)geneandNeogene.Inthisetryandfluorescencemicroscope.TheinhibitioneffectivenessofHpaproteinmunohistochemicalstaining.RESULTS:Th
3、econstructedeukaryoticexpressionvectorseffectivelysuppressedtheHpaexpressionintransfectedcells.The3vectorsofdifferentshorthairpinRNAofHpaeffectivelysuppressedtheexpressioninSKOV3（P0.01）.CONCLUSION:ETAFECTENE轉(zhuǎn)染試劑盒操作方法轉(zhuǎn)染，以含800mg/LG418的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4,接收光為530nm.用Cellquest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取與分析.1.2.6免疫組化染色檢
4、驗(yàn)細(xì)胞Hpa蛋白表達(dá)細(xì)胞爬片，乙醇固定，按SABC方法染色.胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞.陰性（－）：不著色；陽(yáng)性（+）：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小稀疏黃色顆粒；（）：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較密的細(xì)小黃色顆粒；（）：細(xì)胞內(nèi)有明顯的細(xì)小黃色顆粒.將結(jié)果按下面公式計(jì)算.細(xì)胞Hpa蛋白表達(dá)積分＝（+）%×1+（）%×2+（）%×3.2結(jié)果2.1pGenesil1HpashRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒用BamHI做酶切鑒定,陽(yáng)性克隆產(chǎn)生400bp的片段.證實(shí)已將合成的DNA片段成功插入載體pGenesil1中（圖1）.2.2測(cè)序分析經(jīng)測(cè)序結(jié)果證實(shí)3個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建部分的
5、堿基序列與設(shè)計(jì)DNA片段完全一致，堿基無(wú)突變.表明已成功構(gòu)建含兩段目的shRNA片段的重組質(zhì)粒載體.2.3轉(zhuǎn)染效率穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4orBiol,2004,25:329-336.［2］ZhuJ,MuscoML,GraceMJ.ThreecolorfloetryanalysisoftricistronicexpressionofeBFP,eGFP,andeYFPusingEMCVIRESlinkages［J］.Cytometry，1999，37:51-59.［3］BoydDD,NakajimaM.Involvementofheparanaseintumormetastases:Anean
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