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《人乙酰肝素酶基因增強子的初步篩選與鑒定-論文.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、東JS南out大hea學(xué)st學(xué)Un報ivf(M醫(yī)e學(xué)dS版ciEdi)2。13，’。ct；’32(、5)一：543‘548·543·人乙酰肝素酶基因增強子的初步篩選與鑒定陳曉鵬，楊來志，葛國朝，崔巍，屠佳，田野(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院肝膽一科，安徽蕪湖241001)[摘要]目的：初步篩選并鑒定出人乙酰肝素酶(HPSE)基因內(nèi)具有增強子(enhancer，enh)活性的DNA片段。方法：增加nI、SalI酶切位點，將含有報告基因增強型綠色熒光蛋白(pEGFP)質(zhì)粒載體pEGFP—N1改造為pEGFPMU。選取HPSE基因5端啟動子上、下游的DNA序列并分為lO個片段，分別命名為
2、enhx(x分別等于1、2、3??10)，每段長1200bp，相鄰兩段間重復(fù)200bp。分別擴增上述10個片段和猿猴病毒4O(SV40)增強子序列，分別插入pEGFP—MU，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP。MU。enhx和pEGFP。MU。SV40e，并用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染肝癌細胞BEL-7402、胃癌細胞SGC一7901，熒光顯微鏡和流式細胞儀分析上述候選序列對啟動子(CMV)轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序結(jié)果顯示，PCR克隆序列與GeneBank中序列完全一致。酶切電泳和測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pEGFP‘MU。enhx和pEGFP-MU。SV40e構(gòu)建符合要
3、求。瞬時細胞轉(zhuǎn)染、熒光顯微鏡和流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，重組質(zhì)粒pEGFP—MU‘enh6、pEGFP-MU—enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL一7402、SGC一7901細胞中表達增強，與陽性對照質(zhì)粒pEGFP—MU—sv40e相似，其余重組質(zhì)粒表達較弱。結(jié)論：成功克隆人HPSE基因10個增強子候選序列片段，并正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP—MU—enhx；其中第6、7和8候選片段可能具有增強子活性。本研究為后續(xù)進一步篩選和鑒定有活性的增強子序列縮小了搜尋范圍，并為將來利用HPSE增強子進行腫瘤基因治療提供了實驗依據(jù)。[關(guān)鍵詞]乙酰肝素酶；增強子；啟動子；腫瘤；質(zhì)粒[中
4、圖分類號]R34[文獻標識碼]A[文章編號]16716264(2013)05。0543—06doi：10．3969／j．issn．1671—6264．2013．05．003PreliminaryscreeningandidentificationofenhancerfragmentofhumanheparanasegeneCHENXiao’peng，YANGLai。zhi，GEGuo。chao，CUIWei，TUJia，TIANYe(DepartmentofHepatobiliaryDivisionOne，Y~hanHospital，WannanMedicalCollege
5、，Wuhu241001，China)[Abstract]Objective：ToscreenpreliminarilytheDNAfragmentwithenhancer(enh)activityinhumanheparanase(HPSE)gene．Methods：PlasmidvectorpEGFP。N1wasreformedintopEGFP’MUbyaddingtherest。fictionenzymecuttingsitenIandSalIinitsDNAsequence．TheDNAsequencesintheupstreamanddownstreamofhum
6、anHPSEgenepromotorwereselectedanddividedinto10fragments，namedenhx(x=1，2，[收稿日期]2013。02—08[修回日期]2013—04。17[基金項目]安徽省自然科學(xué)基金課題資助項目(11040606M181)；安徽省高校省級自然科學(xué)基金資助項目(kj2010B239)[作者簡介]陳曉鵬(1967一)，男，安徽樅陽人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，教授。E。mail：drcxp@sohu．com[通信作者]陳曉鵬E—mail：drcxp@sohu．corn[引文格式]陳曉鵬，楊來志，葛國朝，等．人乙酰肝素酶基因增強子
7、的初步篩選與鑒定[J]．東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，32(5)：543。548·544·東南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2013年10月，32(5)3，?10)．Everyfragmentwas1200bplong，and200bpwasrepeatedbetweentwoadjacentfragments．Above10fragmentsandtheenhancersequenceofsimianvirus40(SV40)wereamplifiedandinsertedintotheplasmidpEGFP’MUtoc
