乙酰肝素酶的基因分離蛋白表達(dá)及其相互作用蛋白的篩選

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1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文2003屆摘要惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因，腫瘤轉(zhuǎn)移過程是一個(gè)復(fù)雜多步驟的癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)過程，包括癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫離，侵襲周圍組織，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，逃避免疫監(jiān)視，形成腫瘤血管，在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶。其中一個(gè)關(guān)鍵而必需的步驟是腫瘤細(xì)胞穿越基底膜，降解細(xì)胞外基質(zhì)，侵襲周圍組織和血管。很顯然，阻斷腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散是降低腫瘤死亡率和提高生存率的關(guān)鍵因素。但是，目前腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚，缺乏有效的生物防治手段和措施，這也正是該研究領(lǐng)域所面臨的重大研究課題。近年的研究提示，硫酸肝素糖蛋白(h

2、eparansulfateproteoglycan,HsPG)是阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散屏障的重要構(gòu)成成分，對其降解將破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。乙酰肝素酶(heparanase)是一種內(nèi)源性B．葡萄糖醛酸酯酶，識(shí)別HSPG的多糖側(cè)鏈一硫酸肝素鏈(heparansulfate,HS)的特異結(jié)構(gòu)，并將其降解為10．20個(gè)糖單位大小的短糖鏈。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)乙酰肝索酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，降低細(xì)胞問質(zhì)屏障功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵入基質(zhì)和血管壁：另外，此酶還使細(xì)胞外基質(zhì)中貯存的各種生物活性物質(zhì)釋放，誘發(fā)新生腫瘤

3、血管形成；在人類腫瘤組織中，乙酰肝素酶的表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移程度、預(yù)后差呈顯著正相關(guān)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更為其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移提供了直接的證據(jù)。乙酰肝素酶是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一的作用于細(xì)胞外基質(zhì)多聚糖成分的酶，為我們提供了一個(gè)研究開發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥物的重要靶點(diǎn)，深入研究其結(jié)構(gòu)、功能及在腫瘤轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)理并在此基礎(chǔ)上開發(fā)其抑制劑將為腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供新方法。目前，國外已經(jīng)克隆出乙酰肝素酶的全長基因，并在酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)出此蛋白。但是，有關(guān)乙酰肝素酶作為重要的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的研究尚剛剛開始，對其生物學(xué)特性，表達(dá)調(diào)控機(jī)制等方面的研究報(bào)道甚少，國

4、內(nèi)此類研究更屬空白。得到乙酰肝素酶的基因序列，構(gòu)建、乙酰肝素嘲1，J基因分離、蛋白表達(dá)及其相ICfffij蛋白的篩選篩選有效的蛋白表達(dá)載體和宿主細(xì)胞并得到純化蛋白和抗體，以及r解此酶的表達(dá)調(diào)控影響因素等是進(jìn)一步研究中國人／l,t'Pd組織乙酰肝素酶的變化特征和規(guī)律，以及研發(fā)具有自主權(quán)的抗乙酰肝素酶藥物等的重要基礎(chǔ)和前提。本研究正是利用細(xì)胞培養(yǎng)，基因分離、克隆、表達(dá)，蛋白純化等技術(shù)，分離乙酰肝素酶編碼基因的全序列并分別在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和大腸桿菌中表達(dá)乙酰肝素酶蛋白，探討該酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)特征及影響因素(信號(hào)肽等)，加深對乙酰肝素酶生物學(xué)特性的了解

5、，并為進(jìn)一步了解乙酰肝素酶在防治刖，瘤轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，判斷預(yù)后等方面的生物學(xué)作用奠定了重要的基礎(chǔ)。另外，本研究還運(yùn)用蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)一酵母雙雜交技術(shù)，尋找與該酶相互作用的蛋白，研究乙酰肝素酶在體內(nèi)與其它分子的相互作用機(jī)制，以探索其在細(xì)胞內(nèi)定位，轉(zhuǎn)運(yùn)，激活，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。材料和方法：l、細(xì)胞總mRNA乙酰肝素酶基因的分離擴(kuò)增：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞生長至80％匯合時(shí)，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總mR．NA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；設(shè)計(jì)乙酰肝素酶基因的上下游序列，以cDNA為模板，擴(kuò)增編碼基因的全長；直接將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T克隆載體中進(jìn)行

6、測序鑒定。2、乙酰肝素酶在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)：真核表達(dá)載體的構(gòu)建：運(yùn)用亞克隆技術(shù)分別將乙酰肝素酶全長編碼基因和不含信號(hào)肽的乙酰肝素酶基因克隆入真核表達(dá)載體中，構(gòu)建pcDNA4／Myc--HisfullHPA和pcDNA4／Myc--HispartI-IPA兩種載體，分別用PCR、酶切和測序的方法鑒定序列。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA4／Myc--HisfullHPA和pcDNA4／Myc-HispartHPA轉(zhuǎn)染入COS一7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，用Westernblot的方法檢測其蛋白表達(dá)情況。篩選恒定表

7、達(dá)乙酰肝素酶的CHO細(xì)胞株：將pcDNA4／Myc--Hisfull}玎)A鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文2003屆真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用zeocin篩選恒定表達(dá)細(xì)胞株，PCR和Westernblot檢測CHO細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)的情況。3、乙酰肝素酶在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白的純化：構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)蛋白：運(yùn)用亞克隆技術(shù)將乙酰肝素酶的大小亞基分別克隆入原核表達(dá)載體pGEX-2TK，構(gòu)建融合表達(dá)載體和pGEX-2TK一50KDHPA，用氯化鈣法轉(zhuǎn)染入大腸桿菌BL21(PIyS，DE3)中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵：挑選表達(dá)量高的工

8、程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。純化：用直接稀釋法將以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行復(fù)性，離子交換層析法和免疫親和層析法純化目的蛋白。4、運(yùn)用酵母雙雜交技術(shù)篩選相互作用蛋白：構(gòu)建