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《人乙酰肝素酶大亞基蛋白在大腸桿菌中的融合表達(dá)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、人乙酰肝素酶大亞基蛋白在大腸桿菌中的融合表達(dá)作者：李燕杰，李吉學(xué)，凌焱，湯國營，林艷麗，朱厚礎(chǔ)【關(guān)鍵詞】人乙酰肝 Cloning,expressionandcharacterizationofhumanheparanseCterminalsubunitprotEininE.coli 【Abstract】AIM:Toconstructtheexpressionvectorforheparanase(HPA)CterminalsubunitandobtainenoughprotEInforfurth
2、erstudy.METHODS:FullencodinggeneofheparanaseproteinthehumanplatentacDNAlibraryanditsexpressingvectorpGEX2TK50kuHPAinalsubunitgeneintothepGEX2TKvector.Aftertransformedbytheexpressionvector,E.coliBL21(PlyS,DE3)inalsubunitproteinafter1hinductionandkeptpro
3、ducingituntil3hafterinductionaximum.Nodegradationofproducedproteinostlyininclusivebodies.T載體和大腸桿菌BL21（DE3,PlyS）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所二室保存.大腸桿菌DH5α購自華美生物工程公司，表達(dá)載體pGEX2TK購自AmershamPharmacia公司.人胎盤cDNA文庫購自Clontech公司.ExTaq酶，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ,EcoRⅠ，為大連寶生物工程公司產(chǎn)品，T4DNA連接酶為
4、Promega公司產(chǎn)品，溶菌酶為華美公司產(chǎn)品.IPTG為Sigma公司產(chǎn)品，氨芐青霉素為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品，氯霉素購自華美生物工程公司.AntiHPAAntibody(L19)購自SantaCruz公司，HRP標(biāo)記兔抗羊IgG購自北京中山生物技術(shù)有限公司.其余試劑均為國產(chǎn)分析純. 1.2方法 1.2.1分離乙酰肝素酶蛋白編碼基因和測序鑒定以人胎盤cDNA文庫為模板，進(jìn)行PCR.上游引物5′ATGCTGCTGCGCTCGAAGCCTGCGCT3′，下游引物5′TCAGATGCAAGCAGCA
5、ACTTTGGCAT3′.PCR條件為：95℃5min，變性進(jìn)入循環(huán)；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸5min.8g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物后，直接克隆入pGEMT載體，測定基因序列. 1.2.2構(gòu)建載體PGEX2TK50kuHPA根據(jù)測定的乙酰肝素酶核苷酸序列，設(shè)計了如下一對引物擴(kuò)增乙酰肝素酶50ku大亞基基因片段：5′CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC3′，其中GGATCC為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，5′CGGAATTCTCAGATG
6、CAAGCAGCAACTTTGG3′,其中GAATTC為EcoRⅠ酶切位點(diǎn).PCR條件為：95℃5min變性進(jìn)入循環(huán)；94℃30s，60℃30s,72℃30s，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸5min.20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物.將擴(kuò)增出來的乙酰肝素酶基因大亞基的基因產(chǎn)物純化，酶切，與質(zhì)粒載體連接，克隆入PGEX2TK原核表達(dá)載體，構(gòu)建載體PGEX2TK50kuHPA，轉(zhuǎn)化DH5α.測序鑒定表達(dá)載體的序列和閱讀框架. 1.2.3溫度、誘導(dǎo)時間、濃度對表達(dá)的影響①溫度對表達(dá)的影響：將重組表達(dá)質(zhì)
7、粒pGEX2TK50kuHPA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3,PLyS），挑取重組子單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素100mg/L,氯霉素34mg/L）中，分別于25℃，30℃，37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌液，進(jìn)行SDSPAGE分析.②誘導(dǎo)時間對表達(dá)的影響：加入IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)5h誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),每隔1min取1mL培養(yǎng)物，離心收集菌體分析.③誘導(dǎo)劑濃度對表達(dá)的影響：加IPTG至終濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mmol/L，37℃,20
8、0r/min繼續(xù)培養(yǎng)3h，分別取1mL菌液，離心收集菌體分析. 1.2.4表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析取2mL細(xì)菌培養(yǎng)物，離心收集菌體，用去離子水洗滌1次，重懸于1mL去離子水中，超聲波低溫破碎菌體，離心，收集上清，另將所得沉淀用去離子水洗1次，重懸于蒸餾水中，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDSPAGE分析. 2結(jié)果 2.1人乙酰肝素酶基因的分離擴(kuò)增與鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8g/L瓊脂糖凝膠電泳膠上呈單一特異性條帶，長度約1600bp(圖1).經(jīng)序列測定和比較，此基因?yàn)槿艘阴８嗡?/p>
