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《乙酰肝素酶的基因分離蛋白表達及其相互作用蛋白的篩選》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文2003屆摘要惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因，腫瘤轉(zhuǎn)移過程是一個復(fù)雜多步驟的癌細胞與宿主細胞相互作用的連續(xù)過程，包括癌細胞從原發(fā)灶脫離，侵襲周圍組織，進入循環(huán)系統(tǒng)，逃避免疫監(jiān)視，形成腫瘤血管，在遠處器官形成轉(zhuǎn)移灶。其中一個關(guān)鍵而必需的步驟是腫瘤細胞穿越基底膜，降解細胞外基質(zhì)，侵襲周圍組織和血管。很顯然，阻斷腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和擴散是降低腫瘤死亡率和提高生存率的關(guān)鍵因素。但是，目前腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制尚不清楚，缺乏有效的生物防治手段和措施，這也正是該研究領(lǐng)域所面臨的重大研究課題。近年的研究提示，硫酸肝素糖蛋白(h
2、eparansulfateproteoglycan,HsPG)是阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和擴散屏障的重要構(gòu)成成分，對其降解將破壞細胞外基質(zhì)和基底膜的結(jié)構(gòu)，促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。乙酰肝素酶(heparanase)是一種內(nèi)源性B．葡萄糖醛酸酯酶，識別HSPG的多糖側(cè)鏈一硫酸肝素鏈(heparansulfate,HS)的特異結(jié)構(gòu)，并將其降解為10．20個糖單位大小的短糖鏈。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細胞過度表達乙酰肝索酶破壞細胞外基質(zhì)和基底膜，降低細胞問質(zhì)屏障功能，促進腫瘤細胞侵入基質(zhì)和血管壁：另外，此酶還使細胞外基質(zhì)中貯存的各種生物活性物質(zhì)釋放，誘發(fā)新生腫瘤
3、血管形成；在人類腫瘤組織中，乙酰肝素酶的表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移程度、預(yù)后差呈顯著正相關(guān)；動物實驗更為其促進腫瘤轉(zhuǎn)移提供了直接的證據(jù)。乙酰肝素酶是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一的作用于細胞外基質(zhì)多聚糖成分的酶，為我們提供了一個研究開發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移新藥物的重要靶點，深入研究其結(jié)構(gòu)、功能及在腫瘤轉(zhuǎn)移中的分子機理并在此基礎(chǔ)上開發(fā)其抑制劑將為腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供新方法。目前，國外已經(jīng)克隆出乙酰肝素酶的全長基因，并在酵母細胞，昆蟲細胞，哺乳動物細胞中表達出此蛋白。但是，有關(guān)乙酰肝素酶作為重要的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的研究尚剛剛開始，對其生物學(xué)特性，表達調(diào)控機制等方面的研究報道甚少，國
4、內(nèi)此類研究更屬空白。得到乙酰肝素酶的基因序列，構(gòu)建、乙酰肝素嘲1，J基因分離、蛋白表達及其相ICfffij蛋白的篩選篩選有效的蛋白表達載體和宿主細胞并得到純化蛋白和抗體，以及r解此酶的表達調(diào)控影響因素等是進一步研究中國人／l,t'Pd組織乙酰肝素酶的變化特征和規(guī)律，以及研發(fā)具有自主權(quán)的抗乙酰肝素酶藥物等的重要基礎(chǔ)和前提。本研究正是利用細胞培養(yǎng)，基因分離、克隆、表達，蛋白純化等技術(shù)，分離乙酰肝素酶編碼基因的全序列并分別在哺乳動物細胞和大腸桿菌中表達乙酰肝素酶蛋白，探討該酶在細胞內(nèi)的表達特征及影響因素(信號肽等)，加深對乙酰肝素酶生物學(xué)特性的了解
5、，并為進一步了解乙酰肝素酶在防治刖，瘤轉(zhuǎn)移和擴散，判斷預(yù)后等方面的生物學(xué)作用奠定了重要的基礎(chǔ)。另外，本研究還運用蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)一酵母雙雜交技術(shù)，尋找與該酶相互作用的蛋白，研究乙酰肝素酶在體內(nèi)與其它分子的相互作用機制，以探索其在細胞內(nèi)定位，轉(zhuǎn)運，激活，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。材料和方法：l、細胞總mRNA乙酰肝素酶基因的分離擴增：培養(yǎng)HepG2細胞，待細胞生長至80％匯合時，收集細胞，提取細胞總mR．NA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；設(shè)計乙酰肝素酶基因的上下游序列，以cDNA為模板，擴增編碼基因的全長；直接將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T克隆載體中進行
6、測序鑒定。2、乙酰肝素酶在哺乳動物細胞中的表達：真核表達載體的構(gòu)建：運用亞克隆技術(shù)分別將乙酰肝素酶全長編碼基因和不含信號肽的乙酰肝素酶基因克隆入真核表達載體中，構(gòu)建pcDNA4／Myc--HisfullHPA和pcDNA4／Myc--HispartI-IPA兩種載體，分別用PCR、酶切和測序的方法鑒定序列。表達載體轉(zhuǎn)染入細胞：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將構(gòu)建好的真核表達載體pcDNA4／Myc--HisfullHPA和pcDNA4／Myc-HispartHPA轉(zhuǎn)染入COS一7細胞進行瞬時表達，用Westernblot的方法檢測其蛋白表達情況。篩選恒定表
7、達乙酰肝素酶的CHO細胞株：將pcDNA4／Myc--Hisfull}玎)A鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文2003屆真核表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞，用zeocin篩選恒定表達細胞株，PCR和Westernblot檢測CHO細胞中基因轉(zhuǎn)染和蛋白表達的情況。3、乙酰肝素酶在大腸桿菌中的表達及蛋白的純化：構(gòu)建真核表達載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達蛋白：運用亞克隆技術(shù)將乙酰肝素酶的大小亞基分別克隆入原核表達載體pGEX-2TK，構(gòu)建融合表達載體和pGEX-2TK一50KDHPA，用氯化鈣法轉(zhuǎn)染入大腸桿菌BL21(PIyS，DE3)中，進行誘導(dǎo)表達。發(fā)酵：挑選表達量高的工
8、程菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。純化：用直接稀釋法將以包涵體形式表達的目的蛋白進行復(fù)性，離子交換層析法和免疫親和層析法純化目的蛋白。4、運用酵母雙雜交技術(shù)篩選相互作用蛋白：構(gòu)建
