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《雙基因共表達(dá)的tet-on載體的構(gòu)建和檢測》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要Tet．on系統(tǒng)是一種基于四環(huán)素操縱子(tetracyclineoperaon)的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，當(dāng)四環(huán)素(tetracycline，Tet)衍生物強力霉素(doxcycline，Dox)不存在時，反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄活化因子(reversetetracycline．controlledtransactivator,rtTA)不能識別四環(huán)素操縱基因(TetOperator,TetO)，目的基因不表達(dá)；當(dāng)有Dox存在時，rtTA才可與TetO結(jié)合啟動基因的轉(zhuǎn)錄。本研究主要利用FMDV來源的2A序列和EMCV來源
2、的IRES序列兩種共表達(dá)元件，對Tet-on表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造，構(gòu)建了兩個單質(zhì)粒單啟動子的雙報告基因Tet-on表達(dá)載體，利用紅色熒光蛋白dsredI和增強型綠色熒光蛋白egfp兩種報告基因進(jìn)行誘導(dǎo)倍數(shù)的定量檢測。根據(jù)Real．timePCR定量結(jié)果和鏡檢結(jié)果，經(jīng)過改造以后的兩個表達(dá)系統(tǒng)不加入誘導(dǎo)劑時的本底水平均比原來的pTREAutoR3更低，并且得到較為良好的誘導(dǎo)倍數(shù)；兩種不同改造策略得到的共表達(dá)Tet．on載體中，pTREDsRedl．IRES．EGFPAutoR3比pTREDsRedl一2A-EGFPAu
3、toR，本底更低，誘導(dǎo)效率更高。通過改造得到的這種單質(zhì)粒單啟動子的雙報告基因Tet．on表達(dá)載體既能夠?qū)崿F(xiàn)四環(huán)素調(diào)控又能借助共表達(dá)方式以報告基因EGFP的熒光強度作為上游基因表達(dá)量的直觀檢測手段，將來把上游報告基因dsredl替換成功能基因時，就既能由強力霉素調(diào)控外源基因表達(dá)，又能實現(xiàn)功能基因與報告基因共表達(dá)，且同時受Tet．on系統(tǒng)調(diào)控，這樣將既能通過加入誘導(dǎo)劑的時間和劑量來控制功能基因的表達(dá)式時問和表達(dá)量，又能方便地通過對報告基因的直觀檢測來間接地對功能基因進(jìn)行定量，保證基因表達(dá)在動物胚胎發(fā)育階段上的特異性
4、，也可以避免一些有毒性或致死作用的外源基因持續(xù)性表達(dá)對動物胚胎發(fā)育的影響；這將是對Tet．on系統(tǒng)研究的一個補充和創(chuàng)新，并且能大大簡便tet．on系統(tǒng)的操作和功能基因表達(dá)的定量。關(guān)鍵詞：Tet．on，2A，IRES，雙基因共表達(dá)福建師范人學(xué)郊若男碩十學(xué)位論文II}AbstractlIlllIIIIIIlllllllUl＼1807148Tet-onsystemisallinduciblegeneexpressionsystembasedontetracyclineoperaon．Whendoxycycline(D
5、ox)，tetracyclinederivatives，isabsentthereversetetracycline—controlledtransactivator(rtTA)isnotabletorecognizetetracyclineoperator(TetO)，thetargetgenecann’tbeexpressed；onlywhenthereisDox，rtTAisabletorecognizeandcombinewithTetO，thenpromotethetranscriptionoftar
6、getgene．ThisresearchismainlyaboutthetransformationofrecentTet—onsystem，makinguseof2AfragmentfromFMDVandIRESfromEMCV．Twosingle-plasmid，single-promoteranddual．reporterTet—onvectorwereconstructed，dsredlandegfpwereusedasreporterforquantitativedetection．According
7、toReal—timePCRandmicroscopyresults，whenDoxisabsent，thebackgroundexpressionlevelofbothtwomodifiedTet-onsystemsislowerthanthatintheoriginalsystempTREAutoR3，theinductionmultipleisalsobetter．Amongthetwomodifiedsystems，thebackgroundlevelofpTREDsRedl-IRES-EGFPAuto
8、R3islowerandtheinductionmultipleishigher．ThesetwoexpressionsystemsnotonlyCancontroltheexpressionoftargetgeneviaDox，butalsodetectitsexpressionlevelviathefluorescenceintensityofEGFP．Iftheupstreamg
