引物合成知識(shí)資料-賽百盛,金斯瑞

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1、化學(xué)合成的Oligo用于克隆須知（賽百盛）不管化學(xué)合成的OligoDNA為短片段還是長(zhǎng)片段，只要用于PCR克隆，最好對(duì)OligoDNA粗制品進(jìn)行純化。盡管如此，客戶還是須考慮如下風(fēng)險(xiǎn)：????1.內(nèi)部缺失（n-1，n-2etc）產(chǎn)物。這是化學(xué)合成DNA最普遍與最主要的限制因素，且不能通過(guò)純化OligoDNA來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。化學(xué)合成DNA不及活細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制具有高保真性，在活細(xì)胞內(nèi)，存在大量的校正與修復(fù)系統(tǒng)，將堿基突變率降低至1/(1×106)甚至1/(1×109)以下。PCR反應(yīng)也具有較高的保真度，例如：錯(cuò)誤率在1/1000或1/10000。PCR反應(yīng)可通過(guò)DNA聚合酶的性能提高保真度

2、。但是化學(xué)合成DNA與活細(xì)胞及PCR反應(yīng)擴(kuò)增DNA不同，每次合成循環(huán)的錯(cuò)誤率約為1/100，主要包括以下幾方面的因素。????(1)OligoDNA的化學(xué)合成是堿基與堿基之間通過(guò)化學(xué)反應(yīng)偶聯(lián)而成，而化學(xué)反應(yīng)的偶聯(lián)效率一般在99%左右，也就是說(shuō)，在每次進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，都會(huì)有1%的DNA片段附加不上新的堿基，對(duì)這種截?cái)嗟氖⌒蛄?，為了防止其參與后續(xù)的偶聯(lián)反應(yīng)，采用CapA與CapB進(jìn)行化學(xué)封閉，以阻斷其延伸，但化學(xué)封閉反應(yīng)的效率不可能達(dá)到100%。導(dǎo)致出現(xiàn)合成失敗的DNA片段或截?cái)嘈蛄袣埩粼诤铣傻腄NA粗制品中。????(2)OligoDNA的不完全脫保護(hù)。寡核苷酸的完全脫保護(hù)包括從磷酸酯基

3、團(tuán)、堿基上的環(huán)外氨基和5'-OH部分上去掉保護(hù)基團(tuán)。脫保護(hù)的化學(xué)反應(yīng)效率不可能達(dá)到100%，未脫保護(hù)的堿基無(wú)法參加偶聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致oligoDNA內(nèi)部缺失堿基。????(3)不斷延長(zhǎng)的DNA鏈與不斷減少的合成試劑會(huì)干擾oligoDNA的化學(xué)合成。????對(duì)于以上三方面問(wèn)題，至今為止還沒(méi)有找到一個(gè)完美的試劑給予解決。因?yàn)檠娱L(zhǎng)蓋帽時(shí)間也不能保證封閉反應(yīng)效率達(dá)到100%；而對(duì)于脫保護(hù)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，增加脫保護(hù)試劑量及延長(zhǎng)脫保護(hù)時(shí)間又會(huì)導(dǎo)致oligoDNA脫嘌呤。因此只能采取折衷方法將不完全脫保護(hù)與脫嘌呤同時(shí)控制在低水平上。內(nèi)部缺失堿基的截?cái)嘈蛄薪^不可能100%去除干凈，對(duì)于幾種純化方法來(lái)說(shuō)，OPC或H

4、PLC不可能去除內(nèi)部缺失堿基的截?cái)嘈蛄?，最好的方法是通過(guò)PAGE純化降低截?cái)嘈蛄袛?shù)量。????OPC與HPLC純化法是通過(guò)兩種不同形式的柱層析方法對(duì)oligoDNA進(jìn)行純化，PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化，但都不易將缺失一個(gè)堿基（n-1）或兩個(gè)堿基（n-2）的oligoDNA與全長(zhǎng)oligoDNA分離。柱層析與PAGE對(duì)于分析檢測(cè)少量的oligoDNA是一種合適的手段，但作為純化制備目的DNA片段，并不是非常有效。因此，在合成的目的oligoDNA中，總會(huì)存在少量的截?cái)嘈蛄?。由于這些錯(cuò)誤的隨機(jī)性（不同分子有不同的堿基突變，同時(shí)多數(shù)分子沒(méi)有堿基突變），這種序列的錯(cuò)誤率通

5、常對(duì)普通PCR、測(cè)序或雜交不會(huì)存在問(wèn)題，對(duì)于合成不太長(zhǎng)的序列，更是如此。然而，克隆過(guò)程是單個(gè)oligoDNA分子的選擇與擴(kuò)增過(guò)程，若單個(gè)親本分子存在序列錯(cuò)誤，那么單克隆中所有分子都存在相同的序列錯(cuò)誤。????2.單核苷酸的插入是存在于目的oligoDNA產(chǎn)物中的另一種常見(jiàn)的序列錯(cuò)誤。???當(dāng)同一oligoDNA分子中存在G-偶聯(lián)或單堿基插入（n+1）同時(shí)又存在單堿基缺失（n-1）時(shí)，此條oligoDNA的長(zhǎng)度與目的DNA分子的長(zhǎng)度相同，因此無(wú)法通過(guò)OPC、HPLC或PAGE純化將此“失敗序列”去除。????3.OPC、HPLC特別是PAGE是產(chǎn)率損耗很大的純化方法，因此會(huì)導(dǎo)致低產(chǎn)量（OP

6、C與HPLC的得率約為30%~50%，PAGE的得率約為10%~30%），主要的原因是大量的目的oligoDNA分子（全長(zhǎng)與正確的OligoDNA）在純化過(guò)程中會(huì)隨著失敗序列一起被去除。????OligoDNA化學(xué)合成存在的這些弊端曾被HeckerKH與RillR報(bào)道過(guò)（Erroranalysisofchemicallysynthesizedpolynucleotides.Biotechniques,1998Feb;24:256-260）。在這篇文章中，作者合成并PAGE純化了長(zhǎng)鏈oligoDNA，用它們進(jìn)行PCR克隆，然后測(cè)序鑒定了10個(gè)克隆，發(fā)現(xiàn)存在7個(gè)單堿基缺失，一個(gè)連續(xù)的4個(gè)堿基

7、缺失，一個(gè)G-C替換。除了這些堿基錯(cuò)誤，其它學(xué)者還曾報(bào)道存在G-偶聯(lián)、分支及其n+x產(chǎn)物。????解決這些堿基出錯(cuò)的方法：??（1）對(duì)oligoDNA粗制品進(jìn)行純化。不僅要通過(guò)OPC、HPLC、PAGE等方法對(duì)OligoDNA進(jìn)行純化，而且需要優(yōu)化化學(xué)合成方法來(lái)提高OligoDNA的純度。???（2）當(dāng)OPC、PAGE或HPLC純化的OligoDNA用于PCR克隆時(shí)，可能會(huì)存在一些序列錯(cuò)誤的“突變”克?。ㄟ@些堿基錯(cuò)誤的克隆可能源于O