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《dotap 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑使用說明》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、北京普利萊基因技術(shù)有限公司www.applygen.com.cn電話：010-62027915,62053186Email:sale@applygen.com.cnDOTAP真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑使用說明#C1510描述：DOTAP是一種陽離子脂質(zhì)體，可與DNA或RNA形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞，并將核酸釋放入細(xì)胞內(nèi)。它以可靠性和高效性著稱，是廣泛使用的商品化轉(zhuǎn)染試劑。我們的DOTAP真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑是由DOTAP和中性輔助脂質(zhì)以特定比例融合制備而成的單層脂質(zhì)體懸液。這種制備方法增加了脂質(zhì)體對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的高效性、廣譜
2、性、低毒性和可靠性，并使試劑在4°C儲存至少穩(wěn)定12個月。DOTAP可高效轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞，甚至在低濃度血清環(huán)境也可工作良好。它屬于可被生物降解的脂質(zhì)體因而細(xì)胞毒性明顯降低，其轉(zhuǎn)染效率高于Sigma公司的DOTAP單體轉(zhuǎn)染試劑，與Invitrogen的LipofectAMINE相當(dāng)，但其價格僅相當(dāng)同類試劑的1/3。轉(zhuǎn)染時只需將稀釋的DOTAP試劑與DNA溶液混合并室溫放置15分鐘即可加入細(xì)胞。1mlDOTAP可轉(zhuǎn)染100-500μgDNA或50-100只35mm培養(yǎng)皿或250-1000孔24孔板細(xì)胞。顏色：清亮或略呈白
3、色膠體溶液。儲存：4°C儲存12個月。切勿凍存。適用：將DNA、RNA、寡聚核苷酸轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞。適用于大多數(shù)傳代或原代細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟：以生長于24孔板的一個孔內(nèi)的貼壁細(xì)胞為例，使用其它規(guī)格培養(yǎng)皿參見表一。細(xì)胞準(zhǔn)備：轉(zhuǎn)染前一天傳0.5-2x105細(xì)胞于24孔板內(nèi)，加1ml正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。在光鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞群覆蓋培養(yǎng)瓶皿生長表面的85-95%時，為DOTAP轉(zhuǎn)染的最佳時機(jī)。這通常需要18-24小時，但依細(xì)胞類型和接種量而變。注意：傳代時接種過多的細(xì)胞，100%長滿的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率明顯降低制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物：對特定細(xì)胞
4、類型來說，應(yīng)該優(yōu)化加入DNA(μg)和DOTAP(μl)比率和絕對量，參見后面附表。推薦DNA和DOTAP的初始比例為1:4。DNA(μg)：DOTAP(μl)＝1:2～1:8轉(zhuǎn)染實(shí)際上是人為造成細(xì)胞對外源物質(zhì)的高攝取狀態(tài)，因此過量攝入DNA和轉(zhuǎn)染試劑將導(dǎo)致細(xì)胞毒性而降低轉(zhuǎn)染效率。與細(xì)胞接觸的轉(zhuǎn)染混合物中DOTAP的最大濃度不應(yīng)超過30μl/ml，DNA濃度應(yīng)小于5μg/ml。參考表一制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，參照表二進(jìn)行優(yōu)化。下面的步驟以生長于24孔板的單孔貼壁細(xì)胞為例。懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染參見表一后面的說明。1.取1μgDNA稀
5、釋到25μl無血清無抗生素培養(yǎng)基，混勻。2.取2-8μlDOTAP加入到25μl無血清抗生素培養(yǎng)基，輕輕混勻。3.吸取稀釋的DNA溶液加入到稀釋的DOTAP溶液中，上下吹吸混勻，勿振蕩。室溫孵育15分鐘。如果按照相反的順序?qū)⑾♂尩腄OTAP溶液與DNA混合，將生成相反類型的DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物，有可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降。4.在此期間用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1-2次，按照表一Step5加入適宜體積的無血清無抗生素培養(yǎng)基。5.加入步驟3獲得的轉(zhuǎn)染復(fù)合物于培養(yǎng)瓶皿內(nèi)，輕輕混合與細(xì)胞充分接觸，開始轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6.二氧化碳孵箱37C
6、孵育細(xì)胞4小時。7.吸除轉(zhuǎn)染混合物，加入含血清的正常培養(yǎng)基；或直接將含血清培養(yǎng)基加到孔內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時以上。觀察細(xì)胞，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。或1:10稀釋傳代，進(jìn)行G418篩選。Page2of2ApplygenTechnologiesInc.北京普利萊基因技術(shù)有限公司www.applygen.com.cn電話：010-62027915,62053186Email:sale@applygen.com.cn表一DNA和轉(zhuǎn)染試劑稀釋表Step1Step2Step3Step4Step5CultureVesselAreacm2
7、CellNo.DiluteDNA(μg)tomedia(μl)DiluteDOTAP(μl)tomedia(μl)DOTAP:DNAmixtureSerum-freemediainwellTotalTrans.volume96-well0.31′1040.2μgin10μl0.5μlin10μl20μl80μl100μl48-well15′1040.5μgin20μl2μlin20μl40μl100μl140μl24-well21′1051μgin50μl4μlin50μl100μl200μl300μl12-wel
8、l42′1052μgin100μl8μlin100μl200μl400μl600μl6-well105′1054μgin250μl15μlin250μl500μl1000μl1.5ml35-mm105′1054μgin250μl15μlin250μl500μl1000μl1.5ml60-mm301′10610μgin500μl40μlin500μl1000μ
