pcr引物設(shè)計(jì)原則new

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1、引物設(shè)計(jì)原則http://www.hbzhan.com/st50195/Info_11672.html最近更新時(shí)間：2011年4月26日提供商：上海滬宇生物科技有限公司資料大小：0K文件類型：下載次數(shù)：0次資料類型：瀏覽次數(shù)：61次相關(guān)產(chǎn)品：詳細(xì)介紹：?PCR引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度(primerlength)，產(chǎn)物長度(productlength)，序列Tm值(melt

2、ingtemperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplexformationandhairpin)的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)(falseprimingsite)的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量(composition)，等等。必要時(shí)還需對(duì)引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于

3、TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)[2]。2.引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加[2]。3.引物3’端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物[2]。4.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不

4、利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。5.引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(thenearestneighbormethod)[6][7]。6.?G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3’端?G值較低(絕對(duì)值不超過9)，而5’端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的?G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)[6]。7.引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過4.5k

5、cal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行[8]。8.對(duì)引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。[2]擴(kuò)增較大片段DNA的PCR方法一般PCR方法在擴(kuò)增大片段DNA時(shí)的局限性：通常所用的PCR方法都在兩個(gè)方面有局限，即目標(biāo)產(chǎn)物精確程度和合成片

6、段的大小。Pfu(Pyrococcusfuriosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性(3'-editing-exonuclease)，可以將每個(gè)循環(huán)中堿基的錯(cuò)配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。但它在擴(kuò)增1.5-2.0kb片段時(shí)，效率比Klentaql(TaqDNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coliDNA聚合酶IKlenow片段)或AmpliTaq(全長的TaqDNA聚合酶)等聚合酶差；在擴(kuò)增5.0-7.0kb片段時(shí)亦不比各種形式的TaqDNA聚合酶(如AmpliTaq、Klentaq1、Klentaq5等N-末端缺失的變異株)有

7、明顯優(yōu)越之處。因而以往的PCR反應(yīng)產(chǎn)物限制在5.0kb以內(nèi)。超出這一范圍，PCR擴(kuò)增反應(yīng)效率將明顯下降，同時(shí)產(chǎn)物會(huì)降解。即使將延伸時(shí)間定為30分鐘(10倍于通常所需)亦無改進(jìn)。利用兩種DNA聚合酶進(jìn)行較大片段DNA的擴(kuò)增美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的BarnesWM等對(duì)前述問題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，認(rèn)為：PCR反應(yīng)效率低最主要的原因是由于錯(cuò)配的堿基阻礙了延伸反應(yīng)的正常進(jìn)行，PfuDNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯(cuò)配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應(yīng)時(shí)間下；酶濃度較高時(shí)，反應(yīng)效果更差。因此必需將P