蝙蝠葛酚性堿對bxpc3裸鼠抑瘤作用及對vegf表達的影響

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1、蝙蝠葛酚性堿對BXPC3裸鼠抑瘤作用及對VEGF表達的影響1材料與方法　　1.1動物　　裸鼠,體重18～22g,雌雄各半,由黑龍江中醫(yī)藥大學安全性評價中心提供,合格證:SCXK(京)20070001.裸鼠自由進食、飲水,在黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心無菌條件下飼養(yǎng)?！　?.2藥物與試劑　　蝙蝠葛酚性堿(PAMD),黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院王棟教授提供,含量為83%,用時先以1mol/LHCl溶解,再用1mol/LNaOH調pH值至中性,加蒸餾水至所需濃度。實驗時臨時配制成溶液;注射用環(huán)磷酰

2、胺(CyclophosphamideForInjection),江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批準文號:國藥準字H32020857;生理鹽水,哈藥集團制藥六廠,批號:071003B11.碩士論文發(fā)表　　胰腺癌瘤株BXPC3由中國科學院上海生科院細胞資源中心提供。VEGF兔抗鼠多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體HRP多聚體、SP9003檢測試劑盒、PV6001兩步法檢測試劑盒、DAB顯色劑均由南京建成生物技術有限公司生產?！　?.3主要實驗儀器　　生物組織包埋機(湖北孝感);電熱恒溫箱培養(yǎng)箱DPX9

3、162B1;輪轉式組織切片機俫佧2135型;研究用生物顯微鏡OlympusBX60;電子天平(AL204,METTLEYTOLEDO,SeraDXm1200FHⅢE600;格蘭仕中型機型微波爐I1640完全培養(yǎng)液洗1次,接種于培養(yǎng)瓶,待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液。將腫瘤細胞株培養(yǎng)在RPMI1640完全培養(yǎng)液中,置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中,隔日換液,細胞長成單層后,用0.25%胰酶EDTA消化、傳代。待細胞進入對數生長期后,收集細胞并用RPMI1640完全培養(yǎng)基調整濃度為5×106個

4、/ml的細胞懸液備用。在無菌條件下接種于40只裸鼠右腋窩皮下,每只鼠接種0.2ml(含瘤細胞數1×106個).　　1.5分組及給藥方法　　裸鼠40只造模后隨機分為5組,每組8只,分別為蝙蝠葛酚性堿高、中、低劑量組及陽性對照組、模型對照組。各組均腹腔注射給藥,每日給藥劑量為蝙蝠葛酚性堿高劑量20mg/kg,中劑量10mg/kg,低劑量5mg/kg,模型對照組每日給予同等容積生理鹽水,陽性對照組注射用環(huán)磷酰胺156mg/kg(每周給藥1次),連續(xù)21d.　　1.6實驗指標的檢測方法碩士論文發(fā)表　　停藥

5、后次日稱取小鼠體重,脫椎處死小鼠,取瘤塊稱重,計算抑瘤率。免疫組化法(SP)檢測腫瘤組織VEGF表達情況,檢測以細胞漿內出現棕黃色顆粒者為陽性細胞,同一顯微鏡倍數(×40)觀察全片,確定腫瘤浸潤邊緣。然后選擇5個高倍(×400)視野,取所分析的5個不同視野染色細胞平均百分數及平均染色強度評分,評分標準按Mattern[3]的方法進行:根據著色細胞的比例(染色范圍)及染色強度,染色范圍(陽性細胞比率)分為0～4級,陰性為0分;陽性細胞1%～25%為1分;陽性細胞26%～50%為2分;陽性細胞51%～

6、75%為3分;陽性細胞76%～100%為4分。染色強度劃分為0～3級:無色為0分;弱陽性(黃色)為1分;中等強度(棕黃色)為2分;強陽性(棕褐色)為3分,兩者得分相加為最后評分。　　1.7統(tǒng)計方法　　抑瘤實驗結果以±s表示,組間比較用t檢驗。免疫組織化學結果采用秩和檢驗計算,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。2結果　　2.1蝙蝠葛酚性堿對BXPC3裸鼠的體內抑瘤作用　　表1實驗結果表明,蝙蝠葛酚性堿高、中、低劑量組和環(huán)磷酰胺對照組同模型組比較,對BXPC3實體瘤均有不同程度的抑制作用,

7、抑瘤率分別為34.91%,52.83%,41.51%,55.66%,并與模型組比較其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。表1蝙蝠葛酚性堿對BXPC3裸鼠抑瘤作用結果(n=8)　　2.2蝙蝠葛酚性堿對BXPC3裸鼠瘤組織中VEGF表達的影響　　表2免疫組織化學結果顯示:VEGF在模型組瘤組織呈高表達,各實驗組和陽性對照組腫瘤組織VEGF的表達水平均較模型組有所降低;其中中劑量組和環(huán)磷酰胺組的VEGF表達水平顯著降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);高劑量和低劑量組也能降低

8、VEGF的表達,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表2蝙蝠葛酚性堿對BXPC3裸鼠腫瘤VEGF表達水平的影響(n=7)　　3討論　　蝙蝠葛酚性堿對腫瘤的作用日漸被人們所關注,單保恩等[4]證實PAMD對多種不同組織的腫瘤細胞(上皮源性、血源性、腺源性)具有廣譜的抑制作用。本實驗抑瘤實驗結果顯示:PAMD高、中、低劑量組的平均瘤重均明顯低于模型對照組(P<0.01),抑瘤率分別為34.91%、52.83%、41.51%,抑瘤率均大于30%,可初步認為PAMD