大腸桿菌分離鑒定和藥敏實驗方案

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1、雞致病性大腸桿菌的分離培養(yǎng)及藥敏實驗實驗基本步驟：樣品→肝、脾觸片革蘭氏染色鏡檢→普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板分離培養(yǎng)→革蘭氏染色鏡檢、生化實驗鑒定→普通肉湯培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)→藥敏實驗。1病料采集1.1準備材料：試管、載玻片、手術(shù)刀、手術(shù)剪、結(jié)扎繩、記號筆、冰塊、泡沫箱、口罩、手套（該滅菌的都進行高壓蒸汽滅菌）、冰箱。1.2取材部位：血液、肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物，若有雞胚感染則去雞胚及卵黃物。1.3操作方法：將病死雞浸泡在消毒劑溶液中，打開腹腔，無菌采集肝臟、脾臟放于事先準備好的滅菌試管內(nèi)，將帶有腸內(nèi)容物的腸管兩端結(jié)扎放于滅菌是試管內(nèi)。將有明顯病變的臟

2、器入肝、脾進行觸片，做好標記。都貼上標簽，標示采集樣品，來源地，采集時間，采集人。將裝有病料的試管放在放有冰袋的泡沫箱中，及時返回實驗室，置于4℃冰箱待檢。2菌的分離培養(yǎng)及鑒定2.1準備材料：光學(xué)顯微鏡、革蘭氏染色液、載玻片、手術(shù)刀、接種環(huán)、平皿、恒溫箱、高壓鍋、搖床、酒精燈、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化發(fā)酵管，　蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mLpH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基紅試劑、吲哚試劑、乙醚、VP指示劑、超凈臺。培養(yǎng)基：A.普通瓊脂培養(yǎng)基（牛肉粉3g、

3、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，ph7.3±0.1），B.麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（蛋白胨20g、牛膽鹽5g、氯化鈉5g、瓊脂15g，乳糖10g、結(jié)晶紫0.001g、中性紅0.025g，ph7.2±0.2。），C.營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（牛肉粉3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml，ph7.2±0.2）。2．2樣品觸片鏡檢涂片鏡檢：取觸片,進行革蘭氏染色鏡檢。2.2.1在玻片上滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，作用1min，水洗。2.2.2加革蘭氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。2.2.3再加95%酒精脫色，作用15～30s，水洗

4、；加番紅復(fù)染液復(fù)染1min，水洗，自然干燥后鏡檢，觀察細菌染色與形態(tài)。結(jié)果鑒定：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色?？梢姼锾m氏陰性,兩端鈍圓、無芽胞、單個散在的短桿菌。2.3菌的分離培養(yǎng)以無菌操作的方法，將滅菌后的外科手術(shù)刀片燒烙臟器被膜后，再用接種環(huán)刺入臟器實質(zhì)取樣做分離培養(yǎng)。分別接種在普通瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24h，然后觀察，同時進行革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果鑒定：在普通瓊脂平板上生長菌落較為一致,直徑2mm左右,菌落呈圓形、凸起、濕潤、半透明、灰白色;在麥康凱平板上生長出紅色、中等大小、圓形的菌落。2.4革蘭氏染色鏡檢用接種

5、環(huán)挑取一環(huán)生理鹽水蘸于潔凈玻片上，再用接種環(huán)挑取少量麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)2Oh的新鮮菌落,光滑、磚紅色的單個菌落與玻片上的生理鹽水混合，并均勻涂布于玻片上，將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗；滴加番紅染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果鑒定：經(jīng)鏡檢可見到呈紅色的革蘭氏陰性菌，兩端鈍圓，短小桿菌，偶有2～3個菌體相連，無芽孢。2.5生化鑒定?a、糖發(fā)酵試驗取可疑菌分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖發(fā)酵管，37℃培

6、養(yǎng)2～3d，觀察各管產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。b、甲基紅（MR）試驗取可疑菌接種葡萄糖蛋白胨水，37℃培養(yǎng)2～3d，加入甲基紅試劑兩滴，立即觀察結(jié)果，紅色者為陽性，黃色者為陰性。c．吲哚試驗取可疑菌接種至蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～3d。先加入3-4滴乙醚，塞緊棉塞振搖試管，使乙醚與培養(yǎng)液充分混勻，靜置試管架上片刻，待乙醚浮于液面上層時，沿管壁加入吲哚試劑2～3滴，在接觸面呈紅色者即為陽性反應(yīng)。d．VP試驗取可疑菌接種葡萄糖蛋白胨水，37℃培養(yǎng)2～3d，加入VP指示劑，混勻后觀察結(jié)果，呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。結(jié)果鑒定：a.糖發(fā)酵試驗，大腸桿菌能利

7、用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而蔗糖則不被利用。b.甲基紅試驗：陽性。c.吲哚試驗：陽性。d.VP試驗：陰性。2.6菌的增殖培養(yǎng)挑取普通瓊脂平板中表面生長光滑、邊緣整齊、灰白色、半透明的單個微隆起小菌落，劃線接種于普通肉湯中，在37℃恒溫培養(yǎng)24h[5]。結(jié)果鑒定：肉湯呈均勻渾濁，管底有灰白色沉淀，并有糞臭味。3藥敏實驗3.1準備材料：測試藥、生理鹽水、濾紙、青霉素空瓶、酒精燈、接種環(huán)。普通瓊脂平板培養(yǎng)基（牛肉粉3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，ph7.3±0.1）、平皿、超凈臺、恒溫箱。3.2藥敏片的制備3

8、.2.1　藥液的制備：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；如商品藥說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配制藥液，可取1