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1、設計RT-PCR引物方法要鑒定某一個基因在mRNA水平上的表達，需要使用Q-PCR的方法。引物設計是很重要的一環(huán)，要進行Q-PCR時，獲得引物的途徑有很多種，其中最為方便的是使用NCBI和primerbank，首先介紹這一方法：比如你要檢測某藥物對小鼠細胞中IL-2的表達影響，通過Q-PCR檢測，要設計引物。①登陸NCBI，選擇gene，在選框中輸入IL-2mus（搜索小鼠IL-2基因）點擊搜索獲得結果如下：選擇第一個基因，打開，可以獲得gene的ID利用primerbank和ncbi的geneID就
2、可以獲得前人已經設計好的引物①登陸primerbank（http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/），按下圖選擇NCBIgeneID選擇物種mouse，在fortext中輸入前面獲得的你要檢測基因的ID（NCBI的編號）點擊submit查詢，獲得如下結果可以看到其它人設計的好幾對引物，基本上是通過實驗驗證的，做Q-PCR的話直接拿來用就行了，點擊綠色高亮的鏈接可以看到其他人使用這對引物做Q-PCR獲得的結果。二、自己設計Q-PCR引物方法比如要檢測CXCR3的表達，做
3、Q-PCR的擴增目的條帶在100bp左右，如果半定量的話（通過跑膠定量）擴增產物一般400bp左右①登陸NCBI，選擇gene，在選框中輸入CXCR3mus（搜索小鼠CXCR3基因）點擊搜索點擊打開將網頁往下拖到NCBIreferencesequence選擇箭頭所示mRNA序列打開鏈接往網頁下方拖動，可以看到CDS，點擊CDS（編碼蛋白區(qū)）出現如下界面，高亮部分為CDS去ATG起始密碼子TAA終止密碼子復制CDS區(qū)及其附近部分序列，如果要提取基因的話需要完全包括CDS區(qū)，如果只是檢測的話，比如半定量的
4、話就沒必要全部包括。打開primer5軟件，新建一個DNA序列將復制的序列粘貼到選項框中，點擊oK序列就導入了primer5中，然后單擊箭頭所指primer，進入引物設計界面界面如下，點擊search，使用primer自動尋找引物功能進入界面后，分別按下圖選取所需要的參數，PCRproductsize使用默認值即可，primerlength一般在20bp左右比較合適點擊OK后進入如下界面，點擊OK出現如下界面，點擊rating，按打分排列，打分是100分制，分值越高引物越好，根據自己試驗目的，選擇打分
5、高的，產物片段400bp左右的引物對，并且Tm溫度最好在60以上，有義鏈和反義鏈Tm值靠的越近越好，最好不要超過2攝氏度，下圖中Tm行中藍色字體表示有義鏈的Tm值，紅色字體表示反義鏈Tm值，PCR退火溫度一般設置比Tm值低5攝氏度。我選擇的是排行第四的引物對，單擊選擇后在，引物設計窗口，我們可以看到這對引物的具體情況，下圖中紅色箭頭指的S和A分別指的是有義鏈和反義鏈，點擊editprimers可以復制編輯引物選擇引物序列，復制到word文檔中作為正向引物點擊ok后回到primer界面后點擊A，然后點擊
6、Editprimers獲得反向引物序列下面是我獲得的引物序列因為做半定量的模板是整個小鼠基因組，這就需要使用primer-blast驗證引物的特異性（是否不會擴增出其它的基因）進入primer-blast網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在primerparameters中輸入前面設計的正向引物和反向引物在primerpairspecificitychecking中選擇database為refseqmRNA，organism中輸入mo
7、use后選擇mouse最后選擇如下，選擇在新窗口中顯示結果，點擊getprimer。最后出現如下結果，反饋的結果中就只有一個基因 CXCR3，就是我要檢測的基因，證明這對引物的特異性不錯，可以用于實驗。并不是選擇的每一對引物通過blast后就只有一個基因，很多情況下回出現不是只有一個基因的情況，情況如下圖，那就需要再次設計，然后檢驗，直到獲得特異的結果。獲得特異性結果后，可以使用oligo7對所設計的引物進行評價，另外使用primer5的設計的引物在很多情況下總是特異性不是很好，也可以使用oligo7
8、設計引物，oligo7設計的引物特異性會好一些。使用oligo7設計引物新建一個序列將mRNA的序列粘貼到新建對話框中，選擇accept&close選擇searchforprimers&probes分別單擊paremeters和ranges在parameters中根據圖所示選擇引物長度（一般在20bp左右）在ranges中選擇PCR產物的長度范圍和設計引物的范圍單擊search后出現引物對選擇selectedoligonucleotides單擊選擇評分最
