吉西他濱對人非小細胞肺癌a549細胞增殖與凋亡的

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1、吉西他濱對人非小細胞肺癌A549細胞增殖與凋亡的【摘要】目的研究吉西他濱體外對人非小細胞肺癌A549細胞增殖及凋亡的作用。方法應(yīng)用MTT法，流式細胞儀，AnnexinVPI雙標法，Tunel法等多項方法，體外研究吉西他濱對A549細胞的促凋亡作用；采用免疫組化的方法，觀察藥物作用后bcl2表達的變化。結(jié)果吉西他濱對A549細胞生長具有抑制作用，并有促凋亡效應(yīng)，對細胞周期的影響表現(xiàn)為S期的阻滯，藥物處理的細胞凋亡，可見伴有bcl2的下調(diào)。結(jié)論吉西他濱可抑制人非小細胞肺癌A549細胞的生長，并誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，其誘

2、導(dǎo)凋亡是吉西他濱抗腫瘤作用機制的原因之一，而且凋亡與bcl2的表達有一定關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】吉西他濱細胞凋亡非小細胞肺癌bcl2　　0引言　　非小細胞肺癌的預(yù)后比較差，盡管現(xiàn)在的治療不斷發(fā)展，生存率提高的還是很少[1]。凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的主要原因,誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡已成為當前腫瘤治療的熱點。吉西他濱（gemcitabine,2′,2′difluoro2′deoxycytidine,dFdC）是一種新型的脫氧胞苷類似物和核苷還原酶抑制劑，對多種實體瘤具有良好的抗腫瘤活性[2]。但是體外研究其對非小細胞肺癌的

3、凋亡作用及其凋亡機制的研究尚且不多。　　1材料和方法　　1.1藥物與試劑　　吉西他濱（健擇,生產(chǎn)廠家：LILLYFRANCES.A,注冊證號：H20020180），RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清為Gibico公司產(chǎn)品，bcl2單克隆抗體購于北京晶美公司，HEPES，四氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），碘化丙啶（PI），免疫組化試劑盒，AnnexinVPI雙標凋亡試劑盒均為北京中山生物公司產(chǎn)品?！　?.2細胞培養(yǎng)　　人肺腺癌細胞A549由同濟醫(yī)院呼吸內(nèi)科重點實驗室凍存。細胞用含10%小牛血清的RPMI16

4、40培養(yǎng)液在5%CO2,37℃，飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),細胞呈貼壁生長,用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1∶1)消化傳代，用于實驗的細胞均處于指數(shù)生長期?！　?.3細胞體外生長活性的檢測（MTT法）　　取指數(shù)生長期的培養(yǎng)細胞,用0.25%胰蛋白酶消化，以1×104/孔的密度接種于96孔板，每孔設(shè)3個復(fù)孔，以不含細胞的培養(yǎng)液做空白對照。貼壁后，加入不同濃度的吉西他濱,按常規(guī)方法操作后，用酶聯(lián)免疫儀測490nm處的吸光度（A490）值?！　?.4流式細胞儀分析細胞周期　　各組藥物處理細胞72h后，進行細胞消化，

5、收集所有懸浮細胞。調(diào)整細胞密度為5×105～1×106個/ml,取1ml細胞，1000r/min離心5min，去培養(yǎng)基。細胞收集后，加入70%乙醇置于-20℃冰箱固定過夜,PBS洗兩遍。依次加入50μg/ml碘化丙啶（propidiumiodide,PI）和1mg/mlRNaseA,室溫避光染色30min后上機檢測?！　?.5AnnexinVPI雙標記法分析細胞凋亡率　　如上法收集藥物處理72h后的細胞，按試劑盒操作說明書操作后，上流式細胞儀檢測。采用CELIQUEST軟件分析早期細胞凋亡率?！　?.6TUNEL法

6、　　制作不同濃度不同時間作用后的細胞爬片,按試劑盒操作說明書操作。　　1.7bcl2癌基因產(chǎn)物表達檢測　　將各實驗組和對照組在不同藥物濃度下分別培養(yǎng)24h,48h,72h后，制成蓋玻片培養(yǎng)細胞標本，按SP試劑盒說明書操作，用圖像分析儀進行分析?！　?.8統(tǒng)計學(xué)分析　　數(shù)據(jù)以±s表示，用t檢驗分析差異顯著性，采用Pearson相關(guān)分析進行相關(guān)檢驗，運用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)?！　?結(jié)果　　2.1吉西他濱對A549細胞生長增殖能力的影響　　吉西他濱不同濃度對細胞的抑制率可按公式計算:腫瘤細胞的生長抑制率(%)

7、=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%,可見各濃度組對A549細胞均有抑制作用，呈時間、劑量依賴性，差異有顯著性(P<0.05），見圖1?！　D1吉西他濱對人小細胞肺癌細胞A549生長抑制作用（略）　　2.2吉西他濱對A549細胞周期的影響　　在藥物作用72h，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細胞比例不斷增高，處于S期細胞比例降低，對細胞周期有明顯影響，將細胞阻滯與G0/G1期，見表1?！　”?不同濃度吉西他濱對A549細胞周期的影響（略）　　2.3AnnexinVPI聯(lián)合雙染測凋亡率　　結(jié)果顯示

8、，作用72h后，各濃度吉西他濱處理的細胞的凋亡率分別為(4.97±0.4)%、(8.06±0.7)%、(14.67±0.5)%、(30.59±1.1)%、(38.88±0.8)%、(41.32±1.2)%相關(guān)性分析顯示藥物濃度與凋亡發(fā)生呈正相關(guān)，即隨著藥物濃度增加細胞凋亡增加?！　?.4TUNEL檢測　　陰性組僅見藍灰色的凋亡陰性染色吉西他濱處