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《二肽基肽酶iv抑制劑體外篩選模型的建立及應(yīng)用》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、http://www.paper.edu.cn二肽基肽酶IV抑制劑體外篩選模型的建立及應(yīng)用1苗雷1，許泓瑜1，許正宏1,2*1江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院制藥工程實驗室，江蘇無錫（214122）2江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫（214122）E-mail:smartml@163.com摘要:目的建立二肽基肽酶IV抑制劑的篩選模型。方法采用DPPIV活性測定方法,以
Gly-Pro-PNA為反應(yīng)底物，通過測得產(chǎn)物PNA量來檢測DPPIV的活性，對酶量、底物濃度、
最佳溫度、pH及反應(yīng)時間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果當(dāng)酶量為0.5U·L-1、底物濃度為0.262μmol·L-1、
溫度37℃、p
2、H8.2時可獲最大酶活性，并進(jìn)一步對323種中藥進(jìn)行了篩選，水蛭、茯神、
密蒙花等中藥提取物具有DPPIV抑制作用。結(jié)論此方法有效、可行，可作為DPPIV抑制
劑的篩選模型，用來篩選以DPPIV為靶點的降糖藥物。關(guān)鍵詞:二肽基肽酶IV，抑制劑，比色法1引言二肽基肽酶IV(dipeptidylpeptidaseIV,DPPIV;EC3.4.14.5/CD26)是位于細(xì)胞表面的一種絲氨酸肽酶(serinepeptidase)，由Hopsu-Havu和Glenner在鼠肝臟組織勻漿過程中發(fā)現(xiàn)的,廣泛存在于腎臟、胃腸道、結(jié)締組織、淋巴結(jié)等組織中,其催化活性中心位于胞外分子C末端區(qū)域,凡N末端
3、數(shù)第二位上存在脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是該酶發(fā)揮活性的主要底物[1]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞——L細(xì)胞分泌的葡萄糖依賴性腸降血糖素,在體內(nèi)具有抑制血糖升高作用[2],但因為GLP-1的N末端兩個氨基酸為His-Ala,易被DPPⅣ降解而失去活性,所以體內(nèi)極短的半衰期限制了其臨床上的直接應(yīng)用[3]。DPPIV抑制劑能有效延長GLP-1半衰期，增強葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，調(diào)節(jié)血糖濃度，國外已有此類化學(xué)合成藥物上市，如默克公司的西他列汀和諾華公司的維格列汀，還有許多已進(jìn)入三期四期臨床階段，相比以上合成
4、藥物從天然藥物中篩選DPPIV抑制劑有許多優(yōu)點，除了毒性低，生理條件下更為穩(wěn)定外，還有望為合成新藥提供更多的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此建立一種可對天然藥物進(jìn)行DPPIV抑制劑篩選的模型具有理論和實際意義。發(fā)現(xiàn)高效、特異性好、以DPPIV為靶點的降糖藥物，首先需要建立快速、靈敏、可靠、方便的藥物篩選模型。目前國際上篩選DPPIV抑制劑的方法主要有以帶熒光基團(tuán)（AMC/AFC）的Gly-Pro-AMC/AFC為底物的熒光底物法和以甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺（Gly-Pro-PNA）為底物的發(fā)色底物法。前者通過熒光分光光度計測定熒光值高低來確定酶活。這一方法相對可靠，快速，靈敏度高，但成本、技術(shù)和儀器要求
5、均比較高，不適合國內(nèi)普通實驗室開展大規(guī)模藥物篩選，而后者源于NagatsuT,HinoM,FuyamadaH等人在1976年建立了一種以Gly-Pro-PNA作為底物檢測體內(nèi)X-prolyldipeptidy-aminopeptidase活性的方法，該方法建立的反應(yīng)體系為75μmol·L-1glycyne-NaOH緩沖液、1.5μmol·L-1X-Y-p-nitroanilide、酶、純水，總體積為1.05ml[4]。之后以Gly-Pro-PNA作為底物檢測DPPIV活性的比色法開始廣泛被應(yīng)用，在國外被應(yīng)用于從海洋生物中、化學(xué)合成藥物以及組合化學(xué)合成的DPPIV抑制劑中篩選DPPIV
6、抑制劑等。國內(nèi)尚無此類藥物的研究報道。本研究的目的在于，綜合前人經(jīng)驗基礎(chǔ)上建立反應(yīng)體系更微量、反應(yīng)時間更簡短的比色法，方法操作簡便、儀器簡單，并將之用于對323種中藥的篩選。該方法的檢測原理為在堿性條件下DPPIV1本課題得到國家“863”重點項目（2007AA021506）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-07-0380）的資助。-1-http://www.paper.edu.cn催化底物Gly-Pro-PNA水解，生成甘氨酰脯氨酸和黃色的對硝基苯胺，后者在波長405nm處有特征性吸收峰，通過酶標(biāo)儀在405nm處測得的吸光度大小即發(fā)色基團(tuán)PNA生成量多少反映酶活性高低。2材
7、料與方法2.1材料2.1.1藥品DPPIV及IIe-Pro-IIe購于sigma公司，甘氨酰脯氨酸對硝基苯胺購于浙江夸克公司，中藥粉末購于三九醫(yī)藥。2.1.2儀器SPECTRAmaxPLUS384型連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（美國）；PHS-3TC型精密數(shù)顯pH計（上海天達(dá)儀器有限公司）。2.2方法2.2.1DPPIV活性測定及反應(yīng)條件的優(yōu)化DPPIV酶活測定方法參考文獻(xiàn)[5,6,7]并略加修改。實驗分為4組，每組重復(fù)3次，分別為陰性對照組（酶+緩沖液+底物），空白對
