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1、hGDF5基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響作者：任曉勇，張銀剛，陳文弦【關(guān)鍵詞】生長(zhǎng)分化因子5摘要：目的探討人生長(zhǎng)分化因子5(hGDF5)基因轉(zhuǎn)染對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖及分化的影響。方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)方法將hGDF5基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的兔BMSCs，用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RTPCR)、間接免疫熒光檢測(cè)hGDF5mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，并通過檢測(cè)堿性磷酸酶活性、細(xì)胞增殖能力(MTT法)、Ⅱ型膠原(ColⅡ)以及蛋白多糖(PG)的表達(dá)，分析轉(zhuǎn)染hGDF5對(duì)BMSCs增殖、分化的影響。結(jié)果hGDF5mRNA及蛋白在基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)得到正確表達(dá)；hGDF5基因轉(zhuǎn)染組和對(duì)照
2、組相比，ColⅡ、PG表達(dá)水平顯著增高(P<0.01，P<0.01)，而堿性磷酸酶活性和細(xì)胞增殖能力無明顯變化(P>0.05)。結(jié)論外源基因轉(zhuǎn)染可以使BMSCs表達(dá)有生物活性的hGDF5。高表達(dá)的hGDF5可以促進(jìn)BMSCs向軟骨表型分化，但對(duì)細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶活性無明顯影響?！ ￡P(guān)鍵詞：生長(zhǎng)分化因子5；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染；分化 ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofgenetransfectionangroarroesenchymalstemcells(BMSCs).MethodsBMSCsadultNe
3、anGDF5emethod.ThenhGDF5expressionatmRNAandprotEinleveleasuredseparatelybyreversetranscriptionpolymerasereactionandindirectimmunofluorescencemethod.Activityofalkalinephosphates(ALP),expressionofTypeⅡcollagen(ColⅡ),proteoglycanandgroeasuredbybiologicalmethodstoevaluatetheeffectsofhGDF5genetransfe
4、ronthedifferentiationandproliferationofrabbitBMSCs.ResultsAfterhGDF5genetransfection,BMSCsexpressedhGDF5mRNAandprotEIn,andparedRNAandprotein.TheexpressionofheterogeichGDF5genecaninduceBMSCsdifferentiationtochondrogeniccells.ButthegenetransfectionhasnoobviouseffectsontheproliferationandALPactivi
5、tyofBMSCs. KEYSCs);genetransfection;differentiation 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarroesenchymalstemcells,BMSCs)是來源于中胚層的未分化細(xì)胞，因其具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能在組織工程學(xué)領(lǐng)域受到人們的關(guān)注。大量研究證實(shí)，BMSCs在骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導(dǎo)下可以向成軟骨或成骨分化，復(fù)合生物材料移植體內(nèi)可以有效地促進(jìn)組織缺損的修復(fù)。生長(zhǎng)分化因子5(groorphogeicprotein,BMP)家族中與眾不同的成員，是機(jī)體軟骨形成、骨骼發(fā)育過程中重要的調(diào)節(jié)因子。其與細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合移植皮下或肌肉中可以形成
6、軟骨或肌腱樣組織，局部應(yīng)用可以顯著促進(jìn)骨、軟骨、肌腱、韌帶損傷的修復(fù)，從而在組織工程方面展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景[1]。我們采用分子生物學(xué)手段將hGDF5基因體外轉(zhuǎn)染兔BMSCs，初步觀察轉(zhuǎn)染后hGDF5的表達(dá)及其對(duì)干細(xì)胞增殖、分化的影響，為將來用于基因加強(qiáng)組織工程提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！ ?材料與方法 1.1主要試劑和儀器pCA350hGDF5質(zhì)粒(含hGDF5編碼序列)、pcDNA3.1(+)載體由西安交通大學(xué)疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室許鵬博士惠贈(zèng)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NotⅠ購(gòu)自美國(guó)NeanGDF5cDNA、對(duì)照目的基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)限制性內(nèi)切酶譜，設(shè)計(jì)引物。
7、引物5′端和3′端分別引入BamHⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)，上游引物為5′GCTGTTCTGGATCCTGTCATTCAGGGGCTGGCC3′，下游引物為5′TATTCTTACGCCGGCGGCCAGTGCTGCTACCTGCAGC3′。以pCA350hGDF5質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物及pcDNA3.1(+)質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ、NotⅠ酶切，T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素篩選陽性克隆，進(jìn)行酶切、測(cè)序鑒定，重組質(zhì)粒命
