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1、大麥草酸氧化酶與WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控核盤菌抗性的分子機理第一章文獻綜述1病菌的生物學(xué)特性1.1菌核病的基本介紹核盤菌是最為普遍和最具毀滅性的植物病原菌之一，對于這種病原菌造成的病癥有超過60種描述：棉狀腐?。╟ottonyrot），腐?。╮ot），冠腐?。╟roBlight）等。菌核病是一種可以在全球范圍對400多種雙子葉植物造成毀滅性危害的重要經(jīng)濟病害BolandandHall(1994)，菌核病可以對向日葵、大豆、油菜、菜豆、花生、鷹嘴豆、扁豆以及許多蔬菜作物造成危害，同時也可入侵洋蔥、郁金香等單子葉物種。在中國，菌核病居油菜三大病害之首，一般發(fā)病率10～30%，嚴重時可
2、達80%，在長江中、下游及東南沿海主要油菜產(chǎn)區(qū)，包括江蘇、安徽、上海、浙江、期南、湖北、江西等地發(fā)生尤為突出，嚴重影響了我國的油菜生產(chǎn)(李方球，官春云,2001)。1.2核盤菌的生物學(xué)特性菌核病的病原核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary）屬于子囊菌亞門，盤菌綱，柔膜菌目，核盤菌科，核盤菌屬。在這個屬中主要包括：三葉草核盤菌（S.trifoliorum），細辛核盤菌（S.asari），人參核盤菌（S.ginseng），小核盤菌（S.minor)，核盤菌(S.sclerotiorum)。其中感染油菜的主要是核盤菌（S.sclerotiorum
3、）。核盤菌的生活相對比較簡單，一般是通過有性生殖與無性生殖來完成疾病的傳播，這種病原菌在土壤中最主要通過菌核存活下來的，在作物收割后或者通過污染的種子被種到土壤中后，菌核通過感染的植物殘渣與土壤混合；曾經(jīng)報道一千克種子中最高含有432顆菌核。據(jù)報道，菌核可以可以保持活性、毒性以及致病能力達七年之久(ehta,2008)。Hims（1979）則首先在英國觀察到核盤菌以孢子的形式入侵野生植物。.第二章轉(zhuǎn)化大麥草酸氧化酶提高甘藍型油菜菌核病抗性及其抗性機理初析許多真菌在在入侵植物時會將草酸分泌到植物組織中(Cessnaetal.,2000;Kimetal.,2008b;D18-T以及改
4、造的pBI121s。..1.2大麥草酸氧化酶基因片段的獲得及植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建用大麥種子在25℃左右發(fā)芽，液氮冷凍取大麥種子發(fā)芽，用植物高純度總RNA提取試劑盒提（百泰克）取大麥芽總RNA，方法參見百泰克說明書。cDNA第一鏈合成使用FermentascDNA第一鏈合成試劑盒，方法如下：a.取上述提取的總RNA1μg到200μL滅菌離心管中，加入1μLoligodT引物，補充DEPC水到12μL，充分混勻。b.在PCR儀中，有熱蓋的情況下65℃孵育5min，取出放到冰上進行后面步驟操作。c.分別加入4μL5XReactionBuffer、1μLR
5、iboLockRNA酶抑制劑、2μL10mMdNTPMix、1μLRevertAidM-MuLV。d.PCR儀中加熱蓋42℃孵育1h。e.70℃加熱5min終止反應(yīng)。用反轉(zhuǎn)錄的cDNA原液稀釋10倍作模板，根據(jù)已報道的大麥草酸氧化酶（BOXO）（GeneBank登錄號Y14203）序列設(shè)計引物BF、BR，使用EX-TaqDNA聚合酶（TaKaRa）擴增.3討論..............863.1BnSA及擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達表明Bnaoetal.,2011;Qiuetal.,2008)，因此推測WRKY28和WRKY40可能是通過調(diào)控WRKY33來對病原菌起作用的
6、；Atalexin的基因PAD3和CYP71A13是表現(xiàn)出上調(diào)表達的(Pandeyetal.,2010)，說明AtWRKY18和AtWRKY40可能也是通過調(diào)控WRKY33起作用的，而當在BnWRKY40過表達植株中檢測WRKY33的表達量時（結(jié)果中未列出），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株相對于對照是上調(diào)表達的，并且PAD3和CYP71A13都有上調(diào)表達的趨勢，因此BnWRKY40單獨過表達可能對WRKY33起到一個正調(diào)控的作用，這是與之前的報道相吻合的(Xuetal.,2006)。而在BnWRKY28過表達植株，WRKY33卻表現(xiàn)出下調(diào)表達的趨勢（結(jié)果中未列出），因此，推測WRKY28對WRK
7、Y33的表達起到負調(diào)控的作用，AtWRKY28過表達時產(chǎn)生的菌核病抗性可能是通過調(diào)節(jié)其他路徑來實現(xiàn)的，而這里BnWRKY28負調(diào)控WRKY33可能是在植物對環(huán)境刺激的其他方面起作用，如干旱脅迫，鹽脅迫(Babithaetal.,2013;JiangandDeyholos,2009)等。..........
