dna提取原理和方法

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1、DNA提取方法簡介DNA提取的幾種方法基因組DNA的提取CTAB法SDS法其它DNA提取的幾種方法非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法煮沸法線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結(jié)合SDS裂解法基因組DNA－CTAB法CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。具有從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復(fù)

2、合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15℃。CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2

3、+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白）。CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除基因組DNA－CTAB法CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多

4、酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖?；蚪MDNA－CTAB法PVP（聚乙烯吡咯烷酮）PVP按其平均分子量大小分為四級，習(xí)慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實(shí)際上是與PVP水溶液的相對粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強(qiáng)。在研磨過程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機(jī)會。同時向抽提液中加入還原劑β-巰基乙醇，后者能

5、打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。CTAB法流程圖植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－CTAB法SDS法原理基因組DNA－SDS法SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（

6、pH8.0）NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取緩沖液2.65水浴60min,其間緩慢搖動幾次。3.加入150ul的5mol/LKac,混勻,冰浴15min左右SDS法流程圖（以動物組織為例）動物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液基因組DNA－SDS法基因組DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：基因組DNA－其它方法吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有

7、：硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的?；蚪MDNA－其它方法濃鹽法：有機(jī)溶劑抽提法：密度梯度離心法：利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合

8、環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA－堿裂解法堿裂解法流程圖對數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀