鋁暴露對大鼠海馬蛋白激酶cγ亞型影響

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1、鋁暴露對大鼠海馬蛋白激酶Cγ亞型影響【摘要】目的通過研究慢性鋁暴露大鼠海馬蛋白激酶Cγ亞型（PKCγ)的蛋白和mRNA表達的變化，觀察大鼠海馬CA1區(qū)長時程增強（LTP)形成，探討鋁暴露對學習記憶機制的影響。方法選擇斷乳后AN公司）；魚精蛋白、兔抗鼠PKCγ抗體和顯色試劑盒(美國Sigma公司）；PKCγ引物（北京奧科生物技術有限責任公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物公司）；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗（北京中衫生物公司）；［γ-32P］-ATP（北京福瑞公司）；其他試劑均為分析純。　　12染鋁動物模型選

2、擇斷乳后iImager5500V2103圖像分析軟件對實驗結果進行分析，灰度值代表蛋白含量，以對照組蛋白含量為100，鋁中毒組與其對比?！　?6用RT-PCR檢測PKCγ的mRNA表達情況（1)總RNA提?。喝〈笫蠛ｑR50～100mg，按V-gene試劑盒說明書操作提取。(2)cDNA合成：按TakaraRT-PCR試劑盒說明書進行逆轉錄反應，總反應體積20μl。(3)PCR反應：應用PrimerPremier50軟件設計引物，PKCγ的上游引物為：5′-ACCAAGCACCCAGGAAAAC-3′PKCγ的下

3、游引物為：5′-GATGCTGGCTAGAACCAAGC-3′。PCR反應條件：94℃預變性2min，94℃變性30s,515℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環(huán)，72℃延伸10min。β-actin的上游引物為5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'β-actin的下游引物為：5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，產物長度為701bp。PCR反應條件同上。(4)PCR產物的分析：取PCR擴增后的產物51μl進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像，利用凝膠自動分析成像軟件ChemIma

4、ge5500進行灰度值分析，利用β-actin灰度值為內對照，求出PKCγmRNA量的相對值?！　?7統(tǒng)計分析采用SPSS100軟件進行單因素方差分析?！　?結果　　21血鋁和腦鋁的濃度（表1)隨鋁濃度的增加，血鋁和腦鋁的濃度隨之增加。染鋁組與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義（P<005)；02%與04%組比較,差異有統(tǒng)計學意義（P<001)；04%與06%組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005)?！　”?各組大鼠血鋁和腦鋁的比較（略）　　注：與對照組比較，aP<001;與0

5、2%比較，bP<001　　22LTP的測定結果染鋁組大部分大鼠海馬齒狀回LTP增強幅度與對照組比較均有下降。染鋁各組高頻刺激后LTP增加的群體峰電位（PS）幅值比率（02%組，04%組，06％組）與對照組相比均明顯降低，隨著染鋁劑量的增加，LTP增加的PS幅值比率逐漸下降；在對照組中高頻刺激后PS幅值穩(wěn)定且增長平均在150％左右，符合正常的生理現(xiàn)象，而染鋁組高頻刺激后PS幅值基本與初始相同，在45min以后其PS幅值仍然沒有上升到正常的生理范圍，表明染鋁抑制了大鼠LTP的發(fā)生和維持；此外在染鋁組均出現(xiàn)

6、了有長時程抑制（LTD)的現(xiàn)象，而對照組卻未有一例出現(xiàn)。　　23胞漿和胞膜的PKC活性結果（表2）各染鋁組細胞膜PKC活性與對照比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<001)，但染毒組間差異無統(tǒng)計學意義（P>005)。各染鋁組細胞漿PKC活性與對照比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005)，染鋁組間差異無統(tǒng)計學意義（P>005)。細胞膜PKC活性高于細胞漿PKC的活性?！　”?各組大鼠胞膜和胞漿PKC活性的比較（略）　　注：與對照組比較，aP<001　　24PKCγ蛋白表達的結果（圖1）各

7、染鋁組PKCγ的非磷酸化蛋白表達與對照組灰度值的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<005)；染鋁組間灰度值的比較，02％與06％組，P<005;02％與04％組；04％與06％差異無統(tǒng)計學意義（P>005)?！　?5PKCγmRNA表達的結果（圖2）各染鋁組PKCγ的mRNA表達與對照組灰度值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<005);02％與04%,06％組間灰度值的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<005);04％與06％組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>005)

8、?！　D1不同濃度鋁中毒大鼠海馬PKCγ的非磷酸化蛋白表達（略）　　圖2不同濃度鋁中毒大鼠海馬PKCγ的mRNA表達（略）　　3討論　　近年來研究證明〔7〕，PKC與突觸可塑性及LTP的形成密切相關，PKC的激活是LTP產生的重要條件?，F(xiàn)有理論認為，誘導LTP的高頻刺激促進了突觸前膜谷氨酸遞質的大量釋放，使突觸后膜去極化疊加而達到一定程度，從而