鋁暴露對(duì)大鼠海馬蛋白激酶cγ亞型影響

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1、鋁暴露對(duì)大鼠海馬蛋白激酶Cγ亞型影響【摘要】目的通過(guò)研究慢性鋁暴露大鼠海馬蛋白激酶Cγ亞型（PKCγ)的蛋白和mRNA表達(dá)的變化，觀察大鼠海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（LTP)形成，探討鋁暴露對(duì)學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的影響。方法選擇斷乳后AN公司）；魚(yú)精蛋白、兔抗鼠PKCγ抗體和顯色試劑盒(美國(guó)Sigma公司）；PKCγ引物（北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；RT-PCR試劑盒（大連寶生物公司）；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗（北京中衫生物公司）；［γ-32P］-ATP（北京福瑞公司）；其他試劑均為分析純?！　?2染鋁動(dòng)物模型選

2、擇斷乳后iImager5500V2103圖像分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，灰度值代表蛋白含量，以對(duì)照組蛋白含量為100，鋁中毒組與其對(duì)比。　　16用RT-PCR檢測(cè)PKCγ的mRNA表達(dá)情況（1)總RNA提?。喝〈笫蠛ｑR50～100mg，按V-gene試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取。(2)cDNA合成：按TakaraRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總反應(yīng)體積20μl。(3)PCR反應(yīng)：應(yīng)用PrimerPremier50軟件設(shè)計(jì)引物，PKCγ的上游引物為：5′-ACCAAGCACCCAGGAAAAC-3′PKCγ的下

3、游引物為：5′-GATGCTGGCTAGAACCAAGC-3′。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s,515℃退火30s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。β-actin的上游引物為5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'β-actin的下游引物為：5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為701bp。PCR反應(yīng)條件同上。(4)PCR產(chǎn)物的分析：取PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物51μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀掃描成像，利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件ChemIma

4、ge5500進(jìn)行灰度值分析，利用β-actin灰度值為內(nèi)對(duì)照，求出PKCγmRNA量的相對(duì)值?！　?7統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS100軟件進(jìn)行單因素方差分析?！　?結(jié)果　　21血鋁和腦鋁的濃度（表1)隨鋁濃度的增加，血鋁和腦鋁的濃度隨之增加。染鋁組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005)；02%與04%組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001)；04%與06%組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005)。　　表1各組大鼠血鋁和腦鋁的比較（略）　　注：與對(duì)照組比較，aP<001;與0

5、2%比較，bP<001　　22LTP的測(cè)定結(jié)果染鋁組大部分大鼠海馬齒狀回LTP增強(qiáng)幅度與對(duì)照組比較均有下降。染鋁各組高頻刺激后LTP增加的群體峰電位（PS）幅值比率（02%組，04%組，06％組）與對(duì)照組相比均明顯降低，隨著染鋁劑量的增加，LTP增加的PS幅值比率逐漸下降；在對(duì)照組中高頻刺激后PS幅值穩(wěn)定且增長(zhǎng)平均在150％左右，符合正常的生理現(xiàn)象，而染鋁組高頻刺激后PS幅值基本與初始相同，在45min以后其PS幅值仍然沒(méi)有上升到正常的生理范圍，表明染鋁抑制了大鼠LTP的發(fā)生和維持；此外在染鋁組均出現(xiàn)

6、了有長(zhǎng)時(shí)程抑制（LTD)的現(xiàn)象，而對(duì)照組卻未有一例出現(xiàn)?！　?3胞漿和胞膜的PKC活性結(jié)果（表2）各染鋁組細(xì)胞膜PKC活性與對(duì)照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001)，但染毒組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005)。各染鋁組細(xì)胞漿PKC活性與對(duì)照比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005)，染鋁組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005)。細(xì)胞膜PKC活性高于細(xì)胞漿PKC的活性?！　”?各組大鼠胞膜和胞漿PKC活性的比較（略）　　注：與對(duì)照組比較，aP<001　　24PKCγ蛋白表達(dá)的結(jié)果（圖1）各

7、染鋁組PKCγ的非磷酸化蛋白表達(dá)與對(duì)照組灰度值的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005)；染鋁組間灰度值的比較，02％與06％組，P<005;02％與04％組；04％與06％差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005)?！　?5PKCγmRNA表達(dá)的結(jié)果（圖2）各染鋁組PKCγ的mRNA表達(dá)與對(duì)照組灰度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<005);02％與04%,06％組間灰度值的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005);04％與06％組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005)

8、。　　圖1不同濃度鋁中毒大鼠海馬PKCγ的非磷酸化蛋白表達(dá)（略）　　圖2不同濃度鋁中毒大鼠海馬PKCγ的mRNA表達(dá)（略）　　3討論　　近年來(lái)研究證明〔7〕，PKC與突觸可塑性及LTP的形成密切相關(guān)，PKC的激活是LTP產(chǎn)生的重要條件?，F(xiàn)有理論認(rèn)為，誘導(dǎo)LTP的高頻刺激促進(jìn)了突觸前膜谷氨酸遞質(zhì)的大量釋放，使突觸后膜去極化疊加而達(dá)到一定程度，從而