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《vegf 基因在胃癌中的表達(dá)及其意義》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、VEGF基因在胃癌中的表達(dá)及其意義【摘要】目的:探討VEGF基因在胃癌組織中的表達(dá)及意義。方法:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測48例胃癌組織及30例正常組織中VEGF基因的表達(dá)。結(jié)果:48例胃癌組織標(biāo)本中有29例表達(dá)VEGF基因,而30例正常組織均不表達(dá)VEGF基因,兩組比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論:VEGF基因在胃癌組織中有較高的表達(dá),對胃癌病人的免疫治療和預(yù)后有重要意義?!娟P(guān)鍵詞】VEGF基因;胃癌;逆轉(zhuǎn)錄PCR 胃癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一,其惡性程度與各種癌基因、腫瘤抑制因子及幾種生長因
2、子及其受體異常有關(guān)[1~4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgro以上的癌旁組織,共收集標(biāo)本48例,其中男性28例,女性20例;高中分化27例,低分化21例,20例可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;年齡24~78歲,平均年齡61.7歲。所有患者術(shù)前未經(jīng)過化療或放療,病理類型為粘液腺癌、管狀腺癌、印戒細(xì)胞癌。Trizol購自invitrogen公司,cDNA合成試劑盒購自MBI公司?! ?2方法 121RNA的提取Trizol法提取總RNA:組織塊(約100mg)置勻漿器,加Trizol(約2ml)冷凍勻漿,室溫孵育5m
3、in,加入氯仿(0.2ml氯仿/1mlTrizol)用力振蕩15秒,室溫孵育2~3min,4℃,12000rpm離心15min,取上清,加入異丙醇(0.5ml異丙醇/1mlTrizol),室溫孵育60min,4℃,12000rpm離心15min,棄上清,75%乙醇洗滌沉淀一次(至少1ml75%乙醇/1mlTrizol),4℃,7500rpm離心5min,棄上清,風(fēng)干沉淀,加DEPC處理水溶解RNA,-80℃保存?zhèn)溆??! ?22cDNA的合成反應(yīng)體積為20μL,反應(yīng)條件如下:MgCl25mmol/L,10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2μL,dNT
4、P1mmol/L,逆轉(zhuǎn)錄酶15U,核酸酶抑制劑0.5U,Oligo(dT)15引物0.5μg,模板RNA1ug,加無RNase水至終體積20μL。42℃反應(yīng)1h,99℃加熱5min,然后快速冷卻至4℃,以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶,并防止逆轉(zhuǎn)錄酶與cDNA結(jié)合,逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用作PCR反應(yīng)的模板?! ?23PCR引物合成VEGF引物及內(nèi)參照GAPDH引物。VEGF引物序列為:5'ATGGCAGAAGGAGGAGGG3’和5'CGAAACGCTGAGGGAGGCT3',GAPDH的引物為:5’CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA
5、3’和5’ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA3’。 124PCR擴(kuò)增兩對引物的反應(yīng)體系均為25μL,VEGF反應(yīng)體系包括cDNA產(chǎn)物2μL,MgCl21.5mmol/L,10×Buffer2.5μL,dNTP0.04mmol/L,引物濃度0.5μmol/L,Taq酶1U,加去離子水至終體積25μL,混勻后滴加無菌石蠟油覆蓋液面,瞬時離心后置PCR擴(kuò)增儀中擴(kuò)增擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min,然后94℃55sec,50℃55sec,72℃1min24sec,共35個循環(huán),最后72℃延伸5min。GAPDH反應(yīng)體系包
6、括:cDNA模板2μL,MgCl21.5mmol/L,10×Buffer2.5μL,dNTP0.2mmol/L,引物0.5umol/L,Taq酶1U;PCR擴(kuò)增條件為94℃1min,55℃1min,72℃1min24sec,共30個循環(huán),然后72℃延伸5min。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物于含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,80V,1h,紫外透射儀觀察結(jié)果,VEGF基因陽性擴(kuò)增條帶為420bp,內(nèi)參照基因GAPDH擴(kuò)增條帶為200bp?! ?3統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件處理,兩組比較采用χ2檢驗?! ?結(jié)果 GAPDH作為內(nèi)參
7、照,在所有組織標(biāo)本中均有穩(wěn)定表達(dá),用以證實實驗結(jié)果的可靠性。48例胃癌組織標(biāo)本中有29例,30例相應(yīng)正常組織均不表達(dá)VEGF基因(圖1),兩組比較P<0.05,差異有顯著性?! ?分子量標(biāo)準(zhǔn);2、3癌組織;4癌旁組織 圖1VEGF基因的RT-PCR檢測(略) 本研究對VEGF基因表達(dá)與不表達(dá)的胃癌病人進(jìn)行了臨床資料分析,VEGF基因的表達(dá)與年齡、性別、大小、組織學(xué)類型無關(guān),但與腫瘤的浸潤深度、臨床分期及淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)性(P<0.05),見表1?! ”?VEGF表達(dá)與胃癌臨床病理指數(shù)的關(guān)系(略) 3討論
8、胃癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一,手術(shù)仍是主要的治療手段,然而對于術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以及不能手術(shù)的晚期病人,手術(shù)以外的其它治療就顯得尤為必要?;熾m是一種重要的輔助治療方法,但出于腫瘤的耐藥性以及化療藥物的嚴(yán)重副作用,其應(yīng)用受到一