新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸細(xì)胞凋亡率變化及意義

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1、新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸細(xì)胞凋亡率變化及意義作者：董海英，劉健，陳兢芳，卓玲，楊燕珍，吳斌【摘要】　　目的探討新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)腸細(xì)胞凋亡率變化及其與腸組織損傷程度的關(guān)系。方法出生48h的SD大鼠16只隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組，每組8只。模型組給予鼠乳代用品人工喂養(yǎng)，100%氮?dú)馊毖?0s，4℃冷刺激10min，每天2次，連續(xù)3d，建立NEC模型；對(duì)照組與母鼠同籠，鼠乳喂養(yǎng)，未進(jìn)行缺氧冷刺激。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h處死大鼠，留取十二指腸下端至直腸上端腸道組織進(jìn)行腸組織損傷評(píng)分和腸細(xì)胞凋亡率

2、檢測(cè)。每組隨機(jī)抽取2例回盲部近端小腸進(jìn)行腸黏膜透射電鏡檢查。結(jié)果模型組腸組織學(xué)改變與NEC時(shí)改變一致，透射電鏡顯示腸黏膜出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，部分形成凋亡小體。模型組和對(duì)照組腸組織損傷評(píng)分分別為（3.33±0.59）和（0.13±0.17）；腸細(xì)胞凋亡率分別為（31.0±10.6）%和（4.6±3.9）%；二者比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腸細(xì)胞凋亡率與腸組織損傷評(píng)分呈顯著正相關(guān)(r=0.771，P<0.01)。結(jié)論NEC時(shí)腸細(xì)胞凋亡明顯增加。腸細(xì)胞凋亡可能是造成新生鼠NEC腸道進(jìn)行性損傷的病理基礎(chǔ)

3、?！娟P(guān)鍵詞】小腸結(jié)腸炎,偽膜性；嬰兒；新生，疾?。患膊∧Ｐ?，動(dòng)物；細(xì)胞凋亡　　壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizingenterocolitis，NEC)是新生兒時(shí)期嚴(yán)重的腸道炎癥性疾病，是新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房中最常見的外科急癥。雖然大量研究證實(shí)NEC發(fā)病與早產(chǎn)、腸管缺氧缺血、腸內(nèi)喂養(yǎng)、細(xì)菌感染等有關(guān)，但其確切發(fā)病機(jī)制仍不明確[12]。近年來研究證實(shí)，胃腸道屏障功能受損是胃腸功能障礙發(fā)生的病理基礎(chǔ)，是多種嚴(yán)重疾病和器官損傷的共同病理生理過程；其中，胃腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整是維持其屏障功能的形態(tài)學(xué)基

4、礎(chǔ)，腸上皮細(xì)胞及細(xì)胞間相互連接緊密程度及其完整性決定腸黏膜屏障通透性[2]。本研究通過人工喂養(yǎng)、缺氧和冷刺激復(fù)制新生大鼠NEC模型，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腸細(xì)胞凋亡率，結(jié)合腸組織損傷評(píng)分、腸黏膜電鏡觀察，探討新生大鼠NEC發(fā)病過程中腸細(xì)胞凋亡率變化及其與腸損傷的關(guān)系，為闡明NEC的發(fā)病機(jī)制、尋找直接有效的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1動(dòng)物及分組清潔級(jí)新生SD大鼠16只，出生<48h，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)20070005]。剔除每胎>12只或每

5、胎<6只者。每窩5～6只，雌雄不限，體質(zhì)量5～10g。生后48h隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組，每組各8只。模型組新生大鼠與母鼠分開，置入保育箱中，采用鼠乳代用品人工喂養(yǎng)，100%氮?dú)馊毖?0s，4℃冷刺激10min，每天2次，連續(xù)3d，建立新生鼠NEC動(dòng)物模型[3]；對(duì)照組繼續(xù)與母鼠同籠，鼠乳喂養(yǎng)，未進(jìn)行缺氧冷刺激。NEC模型組在造模結(jié)束后24h和對(duì)照組新生鼠空腹斷頭處死，打開腹腔取出十二指腸下端至直腸上端的腸道組織。　　1.2主要試劑雅培加營素蛋白質(zhì)粉由美國雅培公司提供；低出生體質(zhì)量嬰兒配方奶

6、粉由雀巢公司提供；中/長鏈脂肪乳注射液(C6～24)購自華瑞制藥有限公司。胃蛋白酶(美國Sigma公司)；AanxinV/PI試劑盒(美國貝克曼公司)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，自制新生鼠保育箱，保育箱內(nèi)環(huán)境溫度、濕度用Hygro電子溫濕度計(jì)24h監(jiān)測(cè)?！　?.3方法　　1.3.1病理學(xué)檢查取回盲部近端腸管1cm置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，取冠狀切面，HE染色后在光鏡下觀察腸組織形態(tài)學(xué)改變。采用雙盲法進(jìn)行腸組織損傷評(píng)分。參照　　3討論　　腸黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞是腸功能障礙發(fā)生的病理基礎(chǔ)，也是多種嚴(yán)重疾病和

7、器官損傷的共同病理生理過程。腸黏膜受到早產(chǎn)、腸管缺氧缺血、腸內(nèi)喂養(yǎng)、細(xì)菌感染等損傷刺激后引起的損傷導(dǎo)致腸細(xì)胞壞死，在NEC初期僅表現(xiàn)為黏膜層損傷，后期則表現(xiàn)為整個(gè)腸壁透壁性壞死。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，新生兒NEC導(dǎo)致的腸黏膜損傷是壞死；研究證實(shí)，雖然末期NEC組織病理學(xué)表現(xiàn)為典型腸組織廣泛壞死，但在疾病完全發(fā)展之前，腸細(xì)胞凋亡可能是起始的腸黏膜細(xì)胞主要死亡方式，腸細(xì)胞凋亡改變可能導(dǎo)致其易于罹患NEC[12]。Clark等研究顯示，表皮生長因子可保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免于凋亡，從而減少新生鼠NEC發(fā)病率[4]

8、。Feng等研究顯示，給予肝素表皮生長因子可能通過下調(diào)腸細(xì)胞凋亡，維持腸黏膜屏障完整性，從而降低新生鼠NEC發(fā)病率和嚴(yán)重性[5]。Jilling等研究表明，配方奶喂養(yǎng)結(jié)合寒冷與缺氧冷刺激新生鼠小腸導(dǎo)致組織學(xué)改變與NEC時(shí)組織學(xué)改變一致；與母乳喂養(yǎng)的對(duì)照組相比，NEC模型組新生鼠腸黏膜有明顯細(xì)胞凋亡存在，腸細(xì)胞凋亡是最早的大體形態(tài)變化，給予caspase抑制劑則可明顯減少腸細(xì)胞凋亡率和NEC發(fā)病率，這表明新生鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡是引起NEC模型腸道組織壞死的一個(gè)根本病因[6]。但也有學(xué)者對(duì)此提出異議。