新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸細胞凋亡率變化及意義

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1、新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎腸細胞凋亡率變化及意義作者：董海英，劉健，陳兢芳，卓玲，楊燕珍，吳斌【摘要】　　目的探討新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)腸細胞凋亡率變化及其與腸組織損傷程度的關(guān)系。方法出生48h的SD大鼠16只隨機分成模型組和對照組，每組8只。模型組給予鼠乳代用品人工喂養(yǎng)，100%氮氣缺氧90s，4℃冷刺激10min，每天2次，連續(xù)3d，建立NEC模型；對照組與母鼠同籠，鼠乳喂養(yǎng)，未進行缺氧冷刺激。實驗結(jié)束后24h處死大鼠，留取十二指腸下端至直腸上端腸道組織進行腸組織損傷評分和腸細胞凋亡率

2、檢測。每組隨機抽取2例回盲部近端小腸進行腸黏膜透射電鏡檢查。結(jié)果模型組腸組織學(xué)改變與NEC時改變一致，透射電鏡顯示腸黏膜出現(xiàn)大量凋亡細胞，部分形成凋亡小體。模型組和對照組腸組織損傷評分分別為（3.33±0.59）和（0.13±0.17）；腸細胞凋亡率分別為（31.0±10.6）%和（4.6±3.9）%；二者比較差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。腸細胞凋亡率與腸組織損傷評分呈顯著正相關(guān)(r=0.771，P<0.01)。結(jié)論NEC時腸細胞凋亡明顯增加。腸細胞凋亡可能是造成新生鼠NEC腸道進行性損傷的病理基礎(chǔ)

3、?！娟P(guān)鍵詞】小腸結(jié)腸炎,偽膜性；嬰兒；新生，疾??；疾病模型，動物；細胞凋亡　　壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizingenterocolitis，NEC)是新生兒時期嚴重的腸道炎癥性疾病，是新生兒重癥監(jiān)護病房中最常見的外科急癥。雖然大量研究證實NEC發(fā)病與早產(chǎn)、腸管缺氧缺血、腸內(nèi)喂養(yǎng)、細菌感染等有關(guān)，但其確切發(fā)病機制仍不明確[12]。近年來研究證實，胃腸道屏障功能受損是胃腸功能障礙發(fā)生的病理基礎(chǔ)，是多種嚴重疾病和器官損傷的共同病理生理過程；其中，胃腸上皮細胞結(jié)構(gòu)的完整是維持其屏障功能的形態(tài)學(xué)基

4、礎(chǔ)，腸上皮細胞及細胞間相互連接緊密程度及其完整性決定腸黏膜屏障通透性[2]。本研究通過人工喂養(yǎng)、缺氧和冷刺激復(fù)制新生大鼠NEC模型，采用流式細胞儀檢測腸細胞凋亡率，結(jié)合腸組織損傷評分、腸黏膜電鏡觀察，探討新生大鼠NEC發(fā)病過程中腸細胞凋亡率變化及其與腸損傷的關(guān)系，為闡明NEC的發(fā)病機制、尋找直接有效的治療藥物提供實驗依據(jù)?！　?材料與方法　　1.1動物及分組清潔級新生SD大鼠16只，出生<48h，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)20070005]。剔除每胎>12只或每

5、胎<6只者。每窩5～6只，雌雄不限，體質(zhì)量5～10g。生后48h隨機分成模型組和對照組，每組各8只。模型組新生大鼠與母鼠分開，置入保育箱中，采用鼠乳代用品人工喂養(yǎng)，100%氮氣缺氧90s，4℃冷刺激10min，每天2次，連續(xù)3d，建立新生鼠NEC動物模型[3]；對照組繼續(xù)與母鼠同籠，鼠乳喂養(yǎng)，未進行缺氧冷刺激。NEC模型組在造模結(jié)束后24h和對照組新生鼠空腹斷頭處死，打開腹腔取出十二指腸下端至直腸上端的腸道組織?！　?.2主要試劑雅培加營素蛋白質(zhì)粉由美國雅培公司提供；低出生體質(zhì)量嬰兒配方奶

6、粉由雀巢公司提供；中/長鏈脂肪乳注射液(C6～24)購自華瑞制藥有限公司。胃蛋白酶(美國Sigma公司)；AanxinV/PI試劑盒(美國貝克曼公司)。根據(jù)實驗要求，自制新生鼠保育箱，保育箱內(nèi)環(huán)境溫度、濕度用Hygro電子溫濕度計24h監(jiān)測?！　?.3方法　　1.3.1病理學(xué)檢查取回盲部近端腸管1cm置于10%甲醛中固定，石蠟包埋，取冠狀切面，HE染色后在光鏡下觀察腸組織形態(tài)學(xué)改變。采用雙盲法進行腸組織損傷評分。參照　　3討論　　腸黏膜細胞結(jié)構(gòu)破壞是腸功能障礙發(fā)生的病理基礎(chǔ)，也是多種嚴重疾病和

7、器官損傷的共同病理生理過程。腸黏膜受到早產(chǎn)、腸管缺氧缺血、腸內(nèi)喂養(yǎng)、細菌感染等損傷刺激后引起的損傷導(dǎo)致腸細胞壞死，在NEC初期僅表現(xiàn)為黏膜層損傷，后期則表現(xiàn)為整個腸壁透壁性壞死。傳統(tǒng)觀念認為，新生兒NEC導(dǎo)致的腸黏膜損傷是壞死；研究證實，雖然末期NEC組織病理學(xué)表現(xiàn)為典型腸組織廣泛壞死，但在疾病完全發(fā)展之前，腸細胞凋亡可能是起始的腸黏膜細胞主要死亡方式，腸細胞凋亡改變可能導(dǎo)致其易于罹患NEC[12]。Clark等研究顯示，表皮生長因子可保護腸道上皮細胞免于凋亡，從而減少新生鼠NEC發(fā)病率[4]

8、。Feng等研究顯示，給予肝素表皮生長因子可能通過下調(diào)腸細胞凋亡，維持腸黏膜屏障完整性，從而降低新生鼠NEC發(fā)病率和嚴重性[5]。Jilling等研究表明，配方奶喂養(yǎng)結(jié)合寒冷與缺氧冷刺激新生鼠小腸導(dǎo)致組織學(xué)改變與NEC時組織學(xué)改變一致；與母乳喂養(yǎng)的對照組相比，NEC模型組新生鼠腸黏膜有明顯細胞凋亡存在，腸細胞凋亡是最早的大體形態(tài)變化，給予caspase抑制劑則可明顯減少腸細胞凋亡率和NEC發(fā)病率，這表明新生鼠腸黏膜細胞凋亡是引起NEC模型腸道組織壞死的一個根本病因[6]。但也有學(xué)者對此提出異議。