葛根素對(duì)lps誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響及機(jī)制

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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文一、論文摘要題名葛根素對(duì)LPS誘導(dǎo)腳264．7細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響及機(jī)制(中文摘要)研究目的通過(guò)觀察葛根素(Puerarin)預(yù)處理對(duì)細(xì)菌脂多糖(Lipopolys—accharide，LPS)體外誘導(dǎo)激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW264．7后細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子．Id3(nuclearfactor-rB,NF．r,B)及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響，探討其抗炎機(jī)制，為葛根素應(yīng)用于急性肺損傷(AcuteLungInjury，ALl)／急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratoryDistressSyndrome，ARDS)的臨床治療提

2、供理論依據(jù)。方法1、細(xì)胞分組取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LPS模型組(LPS1ug／mL)、葛根素預(yù)處理+LPS組(葛根素100、200、400umol／L預(yù)處理細(xì)胞24h后，換含LPS1ug／mL培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24h)。各組在相同的時(shí)間點(diǎn)加入LPS(空白對(duì)照組加入等量PBS)。2、采用CCK．8法測(cè)定不同濃度葛根素和LPS對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264．7活性的影響，以選擇合適濃度；以檢測(cè)的吸光度(Absorbance，A)值大小作為細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的比較。3、Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡下觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。4、采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞

3、上清液中MIP·2、TNF-a表達(dá)水平。5、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)動(dòng)態(tài)測(cè)定NF-v,Bp65mRNA的表達(dá)。結(jié)果1、采用CCK．8法檢測(cè)及改進(jìn)寇氏法計(jì)算葛根素的最大無(wú)毒濃度(TC0)為520．361urnol／L，半數(shù)毒性濃度(TC50)為5451．77umol／L。當(dāng)葛根素的濃度為100，200，400umol／L時(shí)，與lug／mLLPS共培養(yǎng)均未顯示出細(xì)胞毒性作用(P<0．05)。2、倒置顯微鏡下觀察，未經(jīng)LPS刺激的RAW264．7細(xì)胞體積較小，成球形，少部分成梭形。LPS(1ug／mL)刺激后細(xì)胞形態(tài)向成樹突狀改變(具體表現(xiàn)溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)

4、位論文為胞體增大，形態(tài)不規(guī)則，偽足大量伸出)，葛根素100umol／L組干預(yù)后可明顯抑制LPS導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，葛根素200和400umol／L干預(yù)組的抑制效果更顯著，但最大劑量組仍未達(dá)到LPS刺激前的形態(tài)。3、LPS組細(xì)胞上清中TNF．Q及MIP．2的水平(310．51±26．98pg／mL、384．28+42．59pg／mL)比正常組(41．46+11．68pg／mL、34．81±9．36pg／mL)明顯增高，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

5、、291．29+__23．21pg／mL200umol／L．164．64±18．80Pg／mL、196．17+24．78pg／mL；400umol／L：125．14+15．05pg／mL、81。93±10．50pg／mL)較LPS組明顯降低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、達(dá)量明顯上升，達(dá)到正常對(duì)照組的12．99倍，而經(jīng)過(guò)葛根素100umol／L預(yù)處理后，NF．r,Bp65的釋放受到明顯抑制，下降到正常對(duì)照組的6．49倍，葛根素200和400umol／L干預(yù)組的抑制效果更顯著(4．20倍；2．54倍)，并且葛根素各亞組間Ct值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的(P<0．05)，但最大劑量組NF—r,Bp65的釋放仍未達(dá)到LPS刺激前的水平(P

7、a及MIP-2的水平，經(jīng)葛根素作用后，TNF．a(chǎn)及MIP．2的釋放明顯抑制，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。3、葛根素可下調(diào)經(jīng)LPS活化的巨噬細(xì)胞RAW264．7內(nèi)NF—rJ3p65mRNA的表達(dá)，可能是其抗炎作用的機(jī)制之一。關(guān)鍵詞葛根素；巨噬細(xì)胞；脂多糖；NF—v,．13溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文SubjectEffectofPuerarinPretreatmentonNuclearFactor-剃BandProinflammatoryCytokinesexpressioninMacrophagesRAW264．7activatedwithLPSinVitro(Abstr