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1、芍藥苷對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響常蘊(yùn)青趙中夫劉明社【摘要】目的：觀察芍藥苷對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠單核/巨噬細(xì)胞株(RAGB1）釋放和表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)三代后，轉(zhuǎn)種于放置了無菌處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為對照組、LPS刺激組（100ng/mL）、芍藥苷組（LPS100ng/mL＋芍藥苷0.625mg/mL）；LPS刺激20h后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組培養(yǎng)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)水平。結(jié)果：LPS刺激RAGB1特異性染色變淡，胞漿染色加深，表明HMGB1從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿;芍藥苷組大部分細(xì)胞
2、核HMGB1特異性染色深，而胞漿染色淺，表明芍藥苷抑制HMGB1從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿。對HMGB1免疫組化數(shù)字圖像的累積光密度值分析顯示，HMGB1含量在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=918.67，P0.01），LPS刺激組和芍藥苷組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=22.66,P0.01）。結(jié)論：芍藥苷可能通過抑制HMGB1的核轉(zhuǎn)位和釋放，對LPS誘導(dǎo)的肝損傷起保護(hù)作用。【關(guān)鍵詞】芍藥苷；脂多糖；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；高遷移率族蛋白B1AbstractObjective：Toinvestigatetheeffectsofpaeoniflorinontheexpre
3、ssionofhighmobilitygroupbox1(HMGB1)inRAethods:RAacrophagesLLPStreatmentgroupand0.625mg/mLpaeoniflorintreatmentgroup.After20htreatment,theexpressionofHMGB1easuredbyimmunohistochemicalmethod.Results:At20hafterRAGB1.Keyacrophages;Highmobilitygroupbox1(HMGB1)芍藥苷(paeoniflorin，Pae)為一種
4、蒎烷單萜苷，主要存在于毛莨科植物芍藥（PaeonialactifloraPall）的根皮部，以中藥赤芍中含量最高，毒性極低，具有鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保肝等作用〔１〕。本實(shí)驗(yàn)擬通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激小鼠巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型，觀察芍藥苷對LPS誘導(dǎo)的RAGB1表達(dá)的影響，以探討芍藥苷對其是否具有保護(hù)作用，進(jìn)而深入了解芍藥苷抗炎作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究開發(fā)防治肝病的藥物提供理論依據(jù)。1材料與方法1.1主要試劑芍藥苷：南京替斯艾么中藥研究所；小鼠單核/巨噬細(xì)胞株(RAGB1抗體：英國Abcam公司；新生牛血清
5、（FCS）：杭州四季青公司產(chǎn)品；RPMI-1640：美國Gibco公司；胰蛋白酶：美國Sigma公司；EDTA：華美生物工程公司；UltraSensitiveTMSP超敏試劑盒：福州邁新公司；Tritonx-100：北京中山試劑公司；LPS：美國Sigma公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1.RAI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。為防止LPS干擾，培養(yǎng)基中加入了10μg/mL的多粘菌素B。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合80％后，以0.25％胰蛋白酶＋1mmol/LEDTA溶液消化傳代。1.2.2細(xì)胞活性鑒定：臺盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)：將刺激后的細(xì)胞用EDTA消化后吹
6、打成單細(xì)胞懸液，取0.5mL0.4%的臺盼藍(lán)染液、0.3mLHBSS和0.2mL細(xì)胞懸液，充分混勻。用毛細(xì)吸管吸取少量混合液，注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室，計(jì)數(shù)其中著色的細(xì)胞。細(xì)胞活力=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%1.2.3.芍藥苷抑制LPS誘導(dǎo)RAGB1釋放的免疫組化實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)板作好標(biāo)志分別為A板、B板、C板，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。正常對照組（A1-A6）：培養(yǎng)液1mL；LPS組（B1-B6）：培養(yǎng)液+LPS100ng/mL；芍藥苷組(C1-C6)：培養(yǎng)液+LPS100ng/mL+Pae0.625mg/mL。各孔細(xì)胞在受LPS刺激前先換成無血清的
7、RPMI-1640培養(yǎng)液，孵育2h后以相應(yīng)劑量的LPS刺激，均于刺激20h后，小心取出培養(yǎng)孔內(nèi)載玻片，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次；4％的多聚甲醛固定15min,PBS洗3次，每次3min;每張切片加一滴H2O2阻斷劑溶液，室溫孵育10min，PBS洗3次，每次3min;每張切片加一滴非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育10min;加入含0.3％Tritonx-100的PBS，37℃孵育30min，PBS洗3次，每次3min;除陰性對照孔外，每張切片加一滴1∶250稀釋的抗體，4℃過夜;次日晨，從冰箱取出，室溫下30min,PBS洗3次，每次3min
8、;每張切片加一滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10min，PBS洗3次，每次3min;每張切片加一
