維拉帕米對(duì)lps誘導(dǎo)的大鼠淋巴細(xì)胞凋亡及促炎-抗炎細(xì)胞因子比例的影響論文

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1、維拉帕米對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠淋巴細(xì)胞凋亡及促炎/抗炎細(xì)胞因子比例的影響論文王震李剛祁曉平黎介壽【關(guān)鍵詞】?jī)?nèi)毒素維拉帕米淋巴細(xì)胞凋亡細(xì)胞因子0引言近來研究發(fā)現(xiàn)維拉帕米能夠調(diào)控內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的局部和全身的促炎/抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并且能夠降低試驗(yàn)動(dòng)物死亡率［1-2］.膿毒癥時(shí)促炎/抗炎細(xì)胞因子與淋巴細(xì)胞的凋亡之間的關(guān)系很復(fù)雜，而且維拉帕米對(duì)循環(huán)內(nèi)淋巴細(xì)胞的凋亡、促炎/抗炎細(xì)胞因子平衡方面的體內(nèi)研究很少.因此本研究旨在探討維拉帕米對(duì)LPS誘導(dǎo)的促炎/抗炎細(xì)胞因子平衡、淋巴細(xì)胞凋亡的影響，及其循環(huán)內(nèi)促炎/抗炎細(xì)胞因子比例與淋巴

2、細(xì)胞凋亡的關(guān)系.1材料和方法1.1材料成年雄性SD大鼠(體質(zhì)量250~300g)由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前禁食8h.LPS,維拉帕米，密度梯度離心液Histopaque1.077均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；凋亡試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展公司；TNFα,IL6和IL10ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Biosource公司.1.2方法1.2.1分組及處理42只大鼠隨機(jī)均分為7組：空白對(duì)照組(A)；LPS組(B)；(C～F)不同劑量維拉帕米組；維拉帕米對(duì)照組(G).C～F組大鼠分別給予1,2.5,5,10m

3、g/kg維拉帕米腹腔注射30min后；B～F組大鼠給予腹腔注射LPS(10mg/kg,1μL/g)，LPS用90mL/L無菌生理鹽水配置成1mL/L濃度；G組僅給予10mg/kg維拉帕米.以上各組均于注射后1h，麻醉、處死大鼠.freelin）后，得血清置于-80℃待檢測(cè)，留取抗凝血2～3mL分離淋巴細(xì)胞.1.2.2分離淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞通過密度梯度離心法分離，2～3mL抗凝血置于Histopaque1.077上層，離心700g，30min.分離得細(xì)胞PBS洗滌兩次后，1∶9加入冰紅細(xì)胞裂解液(mmol/L)NH4Cl155

4、,KHCO310,EDTA0.1,4℃，7min.淋巴細(xì)胞純度約98%，活度約97%.1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞凋亡淋巴細(xì)胞凋亡采用試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè).調(diào)整濃度至1×109/L,以200g離心5min，棄上清，PBS洗1次,離心，棄上清，懸浮于500μL結(jié)合緩沖液，加入2μLannexinVFITC和5μLPI染液，混勻后室溫、避光15~30min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè).凋亡細(xì)胞表型為AnnexinV+/PI-.1.2.4檢測(cè)細(xì)胞因子濃度血清TNFα,IL6和IL10濃度采用ELISA試劑盒檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照說明

5、書進(jìn)行.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量數(shù)據(jù)采用x±s表示.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件包進(jìn)行，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（Manned,2001,13:668-670.［2］LiG,QiXP,,BordoniV,etal.Extracorporealtherapiesinnonrenaldisease:Treatmentofsepsisandthepeakconcentrationhypothesis［J］.BloodPurif,2004,22(1):164-174.［4］CavaillonJM,AdibConquyM,CloezTayar

6、aniI,etal.ImmunodepressioninsepsisandSIRSassessedbyexvivocytokineproductionisnotageneralizedphenomenon:ArevieiceinfectedbyrabiesvirusvaccinatedagainstitandimmunomodulatedmunolMicrobiolInfectDis,2004,27(6):393-411.