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《粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、論文題目：自噬相關線粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究答辯委員會主席：答辯委員會成員：溫州醫(yī)學院碩士學位論文目錄中文摘要????????????????????????4英文摘要????????????????????????6引言??????????????????????????8第一部分材料與方法???????????????????????10結果??????????????????????????24第二部分材料與方法???????????????????????27結果????????????
2、??????????????35第三部分材料與方法???????????????????????39結果??????????????????????????41分析與討論???????????????????????44參考文獻????????????????????????48致謝??????????????????????????51附錄??????????????????????????52綜述??????????????????????????53參考文獻????????????????????????63獨創(chuàng)性
3、聲明???????????????????????663溫州醫(yī)學院碩士學位論文自噬相關線粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究中文摘要目的l、建立饑餓誘導的HeLa細胞自噬模型以及相應的檢測指標體系，并以蛋白質組學技術篩選自噬后發(fā)生表達變化的線粒體蛋白質。2、對篩選出的其中一個差異線粒體蛋白質mitofilin進一步進行驗證，以確認其在自噬前后的差異表達。3、探索mitofilin與自噬的關系。方法1、HeLa細胞傳代培養(yǎng)，采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導HeLa細胞產生自噬。2、HeLa細胞自噬檢測：
4、透射電鏡檢測自噬體的雙層或多層膜結構形成；Westernblot檢測正常HeLa細胞與自噬細胞的自噬體標記蛋白LC3。3、HeLa細胞傳代培養(yǎng)，至細胞總量達到約1×108個左右時，采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導HeLa細胞產生自噬，用試劑盒提取正常組與自噬組HeLa細胞線粒體蛋白。4、采用雙向電泳(pH3—10)建立自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的線粒體差異蛋白質圖譜。5、利用PDQuest對雙向圖譜進行分析，篩選出差異蛋白。6、采用LC／MS／MS質譜鑒定上述篩選到的差異蛋白并以Mascot等蛋白質搜索引擎檢索Swis
5、sprot、NCBInr等數據庫，獲得蛋白質信息。7、Westernblot與Real-timePCR驗證差異蛋白之一mitofilin在自噬前后的差異表達。8、克隆mitofilin基因，將其插入pcDNA3．1(+)．HA質粒構建真核表達載體，并合成其siIⅢA片段。9、構建將自噬體特異標記蛋白LC3基因克隆至真核表達載體pEGFP—C1并轉染HeLa細胞，建立GFP—LC3／HeLa穩(wěn)定細胞株，以便于對自噬相關蛋白的功能進行研究。10、采用RNAi和過表達技術，結合饑餓誘導模型與自噬檢測體系，檢測mitofilin
6、高表達／表達受阻的情況下是否誘導／抑制細胞自噬，從而研究其在自噬發(fā)生過程中的作用。4溫州醫(yī)學院碩士學位論文結果1、建立饑餓法誘導HeLa細胞產生自噬的模型及其檢測體系，并摸索確定了線粒體提純方法。2、篩選得到了自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的部分差異線粒體蛋白質。3、Westemblot與Real．timePCR驗證mitofilin在細胞發(fā)生自噬時在mRNA水平與蛋白水平均下調。4、建立了穩(wěn)定表達GFP．LC3的HeLa細胞株，為自噬相關蛋白質的功能研究提供了有利的實驗模型。5、初步的RNAi結果顯示mitofilin很可能參
7、與自噬進程。結論1、成功地建立了饑餓法誘導HeLa細胞產生自噬的模型及其檢測體系。2、驗證線粒體差異表達蛋白mitofilin，在細胞自噬時基因水平與蛋白水平均下調。3、建立mitofilin的過表達與RNAi體系，為探索mitofilin與細胞自噬及線粒體功能的關系打下基礎。關鍵詞自噬饑餓線粒體線粒體內膜蛋白RNA干擾5ABS’I。RAC。I’Objective1．Toestablishastarvation-inducedautophagicHeLacellsmodelandrelevantdetectionsySt
8、ems，andthenscreenoutthedifferentialexpressedmitochondrialproteinsintheprocessofautophagybyproteomicstechniques．2．Validmethedifferentialexpressionofmitofilinina
