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《粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、論文題目：自噬相關(guān)線粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究答辯委員會(huì)主席：答辯委員會(huì)成員：溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文目錄中文摘要????????????????????????4英文摘要????????????????????????6引言??????????????????????????8第一部分材料與方法???????????????????????10結(jié)果??????????????????????????24第二部分材料與方法???????????????????????27結(jié)果????????????
2、??????????????35第三部分材料與方法???????????????????????39結(jié)果??????????????????????????41分析與討論???????????????????????44參考文獻(xiàn)????????????????????????48致謝??????????????????????????51附錄??????????????????????????52綜述??????????????????????????53參考文獻(xiàn)????????????????????????63獨(dú)創(chuàng)性
3、聲明???????????????????????663溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文自噬相關(guān)線粒體蛋白mitofilin的鑒定及其功能的初步研究中文摘要目的l、建立饑餓誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞自噬模型以及相應(yīng)的檢測(cè)指標(biāo)體系，并以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選自噬后發(fā)生表達(dá)變化的線粒體蛋白質(zhì)。2、對(duì)篩選出的其中一個(gè)差異線粒體蛋白質(zhì)mitofilin進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)其在自噬前后的差異表達(dá)。3、探索mitofilin與自噬的關(guān)系。方法1、HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)，采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬。2、HeLa細(xì)胞自噬檢測(cè)：
4、透射電鏡檢測(cè)自噬體的雙層或多層膜結(jié)構(gòu)形成；Westernblot檢測(cè)正常HeLa細(xì)胞與自噬細(xì)胞的自噬體標(biāo)記蛋白LC3。3、HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)，至細(xì)胞總量達(dá)到約1×108個(gè)左右時(shí)，采用饑餓法(以HBSS代替培養(yǎng)基)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬，用試劑盒提取正常組與自噬組HeLa細(xì)胞線粒體蛋白。4、采用雙向電泳(pH3—10)建立自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的線粒體差異蛋白質(zhì)圖譜。5、利用PDQuest對(duì)雙向圖譜進(jìn)行分析，篩選出差異蛋白。6、采用LC／MS／MS質(zhì)譜鑒定上述篩選到的差異蛋白并以Mascot等蛋白質(zhì)搜索引擎檢索Swis
5、sprot、NCBInr等數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得蛋白質(zhì)信息。7、Westernblot與Real-timePCR驗(yàn)證差異蛋白之一mitofilin在自噬前后的差異表達(dá)。8、克隆mitofilin基因，將其插入pcDNA3．1(+)．HA質(zhì)粒構(gòu)建真核表達(dá)載體，并合成其siIⅢA片段。9、構(gòu)建將自噬體特異標(biāo)記蛋白LC3基因克隆至真核表達(dá)載體pEGFP—C1并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，建立GFP—LC3／HeLa穩(wěn)定細(xì)胞株，以便于對(duì)自噬相關(guān)蛋白的功能進(jìn)行研究。10、采用RNAi和過(guò)表達(dá)技術(shù)，結(jié)合饑餓誘導(dǎo)模型與自噬檢測(cè)體系，檢測(cè)mitofilin
6、高表達(dá)／表達(dá)受阻的情況下是否誘導(dǎo)／抑制細(xì)胞自噬，從而研究其在自噬發(fā)生過(guò)程中的作用。4溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文結(jié)果1、建立饑餓法誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬的模型及其檢測(cè)體系，并摸索確定了線粒體提純方法。2、篩選得到了自噬狀態(tài)下與正常狀態(tài)下的部分差異線粒體蛋白質(zhì)。3、Westemblot與Real．timePCR驗(yàn)證mitofilin在細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)在mRNA水平與蛋白水平均下調(diào)。4、建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP．LC3的HeLa細(xì)胞株，為自噬相關(guān)蛋白質(zhì)的功能研究提供了有利的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?、初步的RNAi結(jié)果顯示mitofilin很可能參
7、與自噬進(jìn)程。結(jié)論1、成功地建立了饑餓法誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞產(chǎn)生自噬的模型及其檢測(cè)體系。2、驗(yàn)證線粒體差異表達(dá)蛋白mitofilin，在細(xì)胞自噬時(shí)基因水平與蛋白水平均下調(diào)。3、建立mitofilin的過(guò)表達(dá)與RNAi體系，為探索mitofilin與細(xì)胞自噬及線粒體功能的關(guān)系打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞自噬饑餓線粒體線粒體內(nèi)膜蛋白R(shí)NA干擾5ABS’I。RAC。I’Objective1．Toestablishastarvation-inducedautophagicHeLacellsmodelandrelevantdetectionsySt
8、ems，andthenscreenoutthedifferentialexpressedmitochondrialproteinsintheprocessofautophagybyproteomicstechniques．2．Validmethedifferentialexpressionofmitofilinina
