組蛋白乙?；瘜?duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化調(diào)控作用及機(jī)制

《組蛋白乙酰化對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化調(diào)控作用及機(jī)制》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文組蛋白乙?；瘜?duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的調(diào)控作用及機(jī)制摘要括約肌功能障礙（ISD）是壓力性尿失禁（SUI）的主要原因，現(xiàn)有的治療方法包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療，但這些方法僅改變了盆底解剖結(jié)構(gòu)，均不能糾正ISD，不能從本質(zhì)上恢復(fù)患者的括約肌功能。鑒于近年來運(yùn)用干細(xì)胞移植修復(fù)肌肉損傷、改善肌肉收縮功能的報(bào)道，人們對(duì)干細(xì)胞移植治療SUI寄予厚望。然而至今為止該療法并沒有獲得預(yù)期的療效，究其原因是由于干細(xì)胞移植后既往的研究僅關(guān)注了移植后細(xì)胞表型的變化，對(duì)其在體內(nèi)外分化的機(jī)制研究甚少，導(dǎo)致人們不能很好的

2、運(yùn)用其分化的能力達(dá)到治療疾病的目的，因此研究干細(xì)胞在體內(nèi)外微環(huán)境誘導(dǎo)下的適應(yīng)性變化及機(jī)制顯得十分重要。近年來，組蛋白修飾對(duì)干細(xì)胞分化的影響引起了人們的關(guān)注，組蛋白修飾是指不改變細(xì)胞DNA序列，通過組蛋白亞基發(fā)生乙?；⒓谆裙矁r(jià)修飾，這些修飾可為基因的表達(dá)提供一種識(shí)別的標(biāo)志，為其他蛋白與DNA的結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)，它是一種動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分，稱為組蛋白密碼。這些密碼可被特定蛋白質(zhì)識(shí)別，將其翻譯成特定的染色質(zhì)狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的調(diào)節(jié)，其中，與特異性基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系最為密切的是組蛋白乙酰化修飾，研究表明，組蛋

3、白H3亞基上賴氨酸殘基的乙?；谌旧|(zhì)包裝和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演著重要的角色。一般而言，組蛋白H3K9乙?；c基因的活化有著密切的關(guān)系，相反的，H3K9去乙?；c基因的沉默相關(guān)。一旦有乙?；拇嬖?，DNA的構(gòu)型發(fā)生松解，轉(zhuǎn)錄因子得以與核小體中相應(yīng)的順式作用原件結(jié)合同時(shí)募集相應(yīng)反式作用因子，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。那些組蛋白乙?；潭让芗膮^(qū)域，其下游的DNA呈現(xiàn)出非?；钴S的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。那么干細(xì)胞進(jìn)入特定的微環(huán)境以后，是否也是通過其特定基因發(fā)生了組蛋白修飾，實(shí)現(xiàn)其在特定環(huán)境下重新編程產(chǎn)生與環(huán)境細(xì)胞類似的微環(huán)境適應(yīng)性呢？骨髓間充

4、質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)是一小群存在于骨髓中的非造血細(xì)胞，它具有增殖和多向分化潛能。BMSCs具有取材方便、擴(kuò)增迅速、可自體移植等特點(diǎn)，因此，將其作為種子細(xì)胞用于細(xì)胞治療已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)取材于雌性SD大鼠，分別利用密度梯度離心法和膠原酶消化法，分離培養(yǎng)了BMSCs和BSMCs；并模擬盆底環(huán)境，運(yùn)用接觸共培養(yǎng)方法建立誘導(dǎo)BMSCs向膀胱平滑肌分7第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文化的體外模型，旨在研究BMSCs體外分化為平滑肌過程中，平滑肌相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙

5、?；绞欠癜l(fā)生改變，組蛋白乙?；降母淖儗?duì)BMSCs向BSMCs分化的影響。主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下：一、細(xì)胞培養(yǎng)鑒定及共培養(yǎng)模型的建立1.大鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)無菌操作下取下一月齡雌性SD大鼠雙側(cè)股骨、脛骨，反復(fù)沖洗骨髓腔，混勻沖洗液，離心棄上清后precoll提取所需單核細(xì)胞層，加入含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液中，置37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所得貼壁細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測其分子表型。結(jié)果：成功分離出形態(tài)為梭形的骨髓單核細(xì)胞，其分子表型為：CD31、CD45陰性、CD29、CD44、CD1

6、66陽性。2.大鼠BSMCs的分離與培養(yǎng)無菌條件下取一月齡雌性SD大鼠膀胱，采用膠原酶消化法分離單個(gè)核細(xì)胞，含10%FBS的HG-DMEM培養(yǎng)，獲得貼壁細(xì)胞，免疫熒光法鑒定其標(biāo)志蛋白的表達(dá)。結(jié)果：平滑肌特異性的a-SMA,Calponin和SM-MHC表達(dá)陽性。3.建立大鼠BSMCs誘導(dǎo)BMSCs分化的體外共培養(yǎng)模型以懸掛式細(xì)胞培養(yǎng)小室transwell底層的多孔膜(1um)作為BMSCs和BSMCs之間的間隔，將BMSCs和BSMCs分別接種于多孔膜兩側(cè)作為實(shí)驗(yàn)組，未經(jīng)過接觸共培養(yǎng)的同批次BMSCs作為對(duì)照組

7、。取下接觸共培養(yǎng)3日后BMSCs，RT-PCR檢測其與對(duì)照組成肌分化平滑肌標(biāo)志性蛋白。結(jié)果：RT-PCR顯示接觸共培養(yǎng)組較對(duì)照組的BMSCs中平滑肌標(biāo)志性蛋白的表達(dá)量明顯增加，提示BMSCs在接觸共培養(yǎng)體系中成肌分化，建模成功。二、組蛋白乙?；瘜?duì)BMSCs向BSMCs分化的影響1.ChIP、qPCR分析平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?；綄?duì)BMSCs向平滑肌分化的影響實(shí)驗(yàn)采用ChIP技術(shù)，在活細(xì)胞狀態(tài)下甲醛固定共培養(yǎng)前后BMSCs中蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，超聲打斷染色質(zhì)片段，調(diào)整片段大小在200-1000bp

8、，然后通過抗組蛋白特定乙?；稽c(diǎn)H3K9抗體沉淀分化前后BMSCs基因組，定量PCR擴(kuò)增BMSCs中平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)DNA片段，了解干細(xì)胞分化前后啟動(dòng)子區(qū)域乙?；潭鹊淖兓闆r，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。結(jié)果：共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后，BMSCs平滑肌標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)乙?；潭容^未分化前明顯增加，啟動(dòng)子區(qū)域DNA的乙?；龠M(jìn)了BMSCs向BSMCs分化。2、組蛋白去乙?；?/p>