磁刺激對(duì)小鼠原代海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)、突觸蛋白及bdnf-trkb信號(hào)通路表達(dá)的影響

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1、河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文磁刺激對(duì)小鼠原代海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)、突觸蛋白及BDNF--TrkB信號(hào)通路表達(dá)的影響姓名：馬雋申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：崔慧先201204中文摘要維甲酸受體Gt在全反式維甲酸調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞KLF4表達(dá)中的作用及機(jī)制研究摘要目的：Krnppel樣因子4(Kmppel．1ikefactor4，KLF4)是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在多種組織和細(xì)胞中廣泛存在。在不同細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，KLF4作為一種基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，可激活或抑制多種基因的轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)包括增殖、分化、發(fā)育、炎癥和凋亡在內(nèi)的多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。因此，KLF4基因的表達(dá)調(diào)節(jié)和功能改變是影響

2、細(xì)胞生物學(xué)行為的重要因素之一。前期的研究表明，KLF4基因功能的調(diào)節(jié)是復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)過(guò)程，既可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，又可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后翻譯修飾水平調(diào)節(jié)，后者包括磷酸化、乙?；?、蘇素化及泛素化等過(guò)程的調(diào)節(jié)。此外，大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，多種刺激因素均可影響細(xì)胞內(nèi)KLF4的水平，如血清饑餓、氧化應(yīng)激、血小板衍生生長(zhǎng)因子．BB(platelet．derivedgrowthfactor-BB，PDGF．BB)、丁酸鹽、環(huán)孢素、硒、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p(transforminggrowthfactor-13，TGF．p)、干擾素小環(huán)腺苷酸(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)和全反

3、式維甲酸(all—transretinoicacid，ATRA)。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，ATRA除可誘導(dǎo)KLF4表達(dá)外，還可以促進(jìn)KLF4乙?；土姿峄揎棧M(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)分化標(biāo)志基因SM22僅和SM0【．a(chǎn)ctin并促進(jìn)VSMC向分化表型轉(zhuǎn)化。此外，Owens等人發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白，1(transcriptionfactorstimulatingprotein．1，Spl)參與VSMC中K1f4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)；Yang等人報(bào)道KLF4可通過(guò)自調(diào)控方式調(diào)節(jié)Klf4基因轉(zhuǎn)錄。ATRA是膳食攝入維生素A的代謝產(chǎn)物，可通過(guò)結(jié)合

4、其胞內(nèi)核受體RAR和RXR而直接調(diào)節(jié)下游靶基因轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)VSMC分化。RAR可與靶基因啟動(dòng)子區(qū)的維甲酸應(yīng)答元件(retinoicacidresponseelement，RARE)直接結(jié)合而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。未結(jié)合配體的RAR往往與輔抑制子構(gòu)成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體而使基因沉默；結(jié)合配體后，RAR募集一系列輔轉(zhuǎn)錄激活因子從而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。此外，RAR還可通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而間接調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，如RAR可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子Spl／Sp3或STAT5中文摘要結(jié)合而間接結(jié)合在啟動(dòng)子區(qū)的Spl／Sp3或STAT5結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。目前，RAR被認(rèn)為是治療VSMC增殖性疾病的重要靶分子。在臨床治療中

5、，ATRA已經(jīng)成功的運(yùn)用于白血病、癌癥及動(dòng)脈再狹窄和斑塊形成等疾病的治療。然而，ATRA誘導(dǎo)Klf4基因表達(dá)的分子機(jī)制目前仍不十分清楚。本研究系統(tǒng)的探討了VSMC中ATRA信號(hào)在誘導(dǎo)Klf4基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的作用及其分子機(jī)制。方法：細(xì)胞培養(yǎng)，腺病毒及質(zhì)粒載體的構(gòu)建，定點(diǎn)突變，小干擾RNA轉(zhuǎn)染，RNA提取及定量RT-PCR分析，Westem印跡分析，熒光素酶報(bào)告基因分析，染色質(zhì)免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull．down分析，GSTpull．down分析，免疫共沉淀分析，BrdU摻入分析，細(xì)胞遷移分析，鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色等。結(jié)果：1RARa介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá)ATRA通過(guò)與其受體R

6、AR和RXR結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的作用。RAR有三種亞型：RARer、RARI)和RART，分別由不同的基因編碼。本部分研究證實(shí)RARer，而不是RARl3或RARy，參與了ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá)。結(jié)果如下：1．1ATRA以濃度和時(shí)間依賴(lài)性方式誘導(dǎo)KLF4和RAR(I表達(dá)為了探討ATRA誘導(dǎo)KLF4與ATRA受體(RARa、RARl3和RARv)表達(dá)之間的關(guān)系，我們首先應(yīng)用Western印跡分析方法檢測(cè)不同濃度ATRA刺激VSMC不同時(shí)間后，KLF4和三種RAR的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ATRA可顯著誘導(dǎo)KLF4和RAR(I的表達(dá)，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性。然而，ATRA刺激后，RARl3和R

7、AIⅥ表達(dá)水平無(wú)顯著變化。1．2RA_R0t介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)的Klf4基因表達(dá)為了進(jìn)一步探尋介導(dǎo)ATRA誘導(dǎo)Klf4基因轉(zhuǎn)錄的核受體，我們應(yīng)用小干擾RNA(si—RAR0t，si—RAR[3和si—RARv)分別敲低三種內(nèi)源性RAR的表達(dá)。結(jié)果顯示，在敲低內(nèi)源性砒訊0【的細(xì)胞中，ATRA對(duì)Klf4表達(dá)的誘導(dǎo)作用受到顯著抑制。用RAR(t選擇性抑制劑Ro41．5253抑制RAR(I活性后再用ATRA刺激VSMC