中國北方棉區(qū)棉花立枯病菌融合群鑒定及優(yōu)勢融合群的特異性檢測

中國北方棉區(qū)棉花立枯病菌融合群鑒定及優(yōu)勢融合群的特異性檢測

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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中國北方棉區(qū)棉花立枯病菌融合群鑒定及優(yōu)勢融合群的特異性檢測姓名:井巖申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):植物病理學(xué)指導(dǎo)教師:于金鳳20120615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要棉花立枯病是棉花苗期重要的土傳真菌病害之一,該病害在棉花苗期發(fā)生普遍,尤其是重茬棉田,發(fā)病率高達(dá)50%--60%,直接影響棉花的密植勻株,間接誘發(fā)中后期病害及鈴病的發(fā)生,嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國是世界上的產(chǎn)棉大國,2004-2008年間棉花均產(chǎn)量達(dá)678.14萬噸,占世界原棉年均總產(chǎn)量的27.91%,如何有效的防治棉花立枯病害具有重要意義。以山東、河北和河南為代表的北方棉區(qū)是我

2、國棉花主產(chǎn)區(qū)之一,常年種植面積和總產(chǎn)量均占全國的25%以上,棉花立枯病對該地區(qū)棉花的危害比較嚴(yán)重,本研究對該地區(qū)棉花立枯病菌的融合群類群進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定并對其優(yōu)勢融合類群AG4一HG.I進(jìn)行了特異性檢測,主要研究結(jié)果如下:1.從山東、河北和河南三省采集棉花立枯病標(biāo)本和土壤各100余份,使用帶菌土壤溫室中種植棉苗誘發(fā)病菌,從誘導(dǎo)發(fā)病的植株上再分離病菌,以此作為對一些田間標(biāo)本采集量不足的補(bǔ)充。對采集到的棉花立枯病病株采用常規(guī)組織分離方法進(jìn)行分離,獲得198個絲核菌分離物。融合群測定結(jié)果表明,這些菌株分別屬于多核絲核菌的AG4.HG.I、AG4.HG.IⅡ融合群以及雙核絲核菌的

3、AG.A、AG.F、AG.Fb融合群。其中AG4一HG.I是優(yōu)勢融合類群,占分離菌株總數(shù)的88.38%,其次是AG4一HG—III群,占10.10%,AG.A、AG.F、AG-Fb各僅有l(wèi)株。雙核絲核菌AG-A、AG.F和AG—Fb融合群是國內(nèi)首次從棉花植株上分離獲得。2.菌株的核相觀察顯示:雙核類的絲核菌細(xì)胞核均為2個;多核類的在3個以上。AG4一HG.I和AG4.HG.III雖然都屬于多核類的AG-4融合群,但是兩個不同亞群的細(xì)胞核數(shù)目存在較大差異:AG4一HG.I亞群菌株細(xì)胞核數(shù)目在亂10個之間,AG4.HG.HI亞群菌株細(xì)胞核數(shù)目在3~5個之間。3.利用5.8S

4、rDNA-ITS區(qū)序列分析方法,對該地區(qū)棉花立枯病菌不同融合群代表菌株的系統(tǒng)演化關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,相同融合群(或亞群)的菌株,序列一致率達(dá)98~100%,而不同融合群(或亞群)菌株之間差異較大。說明此基因序列可以對絲核菌不同融合群或亞群的菌株進(jìn)行有效區(qū)分和鑒定。依據(jù)本研究測得的16個代表菌株及13個源自GenBank且隸屬不同融合群的菌株序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出,所有供試菌株被分成三個大組。第一組為多核類絲核菌,包括AG-4融合群的兩個亞群即AG4.HG.I和AG4.HG.III,這兩個亞群在進(jìn)化上關(guān)系較近;第二組為兩個雙核類絲核菌中國北方棉區(qū)棉花立枯病菌

5、融合群鑒定及優(yōu)勢融合群的特異性檢測群,為AG—F和AG.Fb兩個融合群;第三組為雙核類的AG—A融合群。進(jìn)一步分析各融合群間的進(jìn)化關(guān)系可以看出,雙核類的AG.F和AG.Fb兩個融合亞群與多核類的AG-4融合群親緣關(guān)系相近,而同屬于雙核絲核菌的AG。A與AG-4融合群的進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn)。4.采用麥粒一土壤接種法對棉花立枯病菌的優(yōu)勢融合類群AG4-HG.I菌株以及分離得到的雙核絲核菌進(jìn)行致病性測定。結(jié)果表明,所有的AG4.HG.I群菌株均有較強(qiáng)的致病性,平均病情指數(shù)為55""100,三個雙核絲核菌對棉花幼苗的平均病情指數(shù)為12.77。5.用三個雙核絲核菌針對棉花立枯病優(yōu)勢致

6、病群AG4-HG-I進(jìn)行生防效果測定,用DPS軟件對病情指數(shù)進(jìn)行studentt值檢驗(yàn)。結(jié)果表明:三個雙核絲核菌菌株對棉花立枯絲核菌AG4.HG.I融合群菌株的生防效果不明顯?!?.利用35個ISSR引物對來自不同寄主上的AG4一HG—I融合群菌株(8個),以及12個其他融合群菌株進(jìn)行ISSR分析。從中選取出8個能對AG4一HG-I群菌株擴(kuò)增出特異性條帶的引物,利用這些引物對各融合群代表性菌株進(jìn)行ISSR—PCR擴(kuò)增,將僅對AG4.HG'I融合群特異的片段進(jìn)行膠回收、測序,并根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)出針對AG4.HG.I的特異性引物對?!?.用所合成的引物進(jìn)行特異性檢測結(jié)果表明

7、,引物對J6.S和J6.A能針對AG4-HG.I群菌株擴(kuò)增出特異性片段,所擴(kuò)增的片段大小為363bp,屬于其他融合群的絲核菌菌株沒有擴(kuò)增到任何片段;利用設(shè)計(jì)的引物分別檢測用AG4一HG.I融合群菌株接種的土壤、采自連作棉田的土壤、采自麥田的土壤、滅菌土壤,一次PCR僅在AG4-HG.I融合群菌株接種的土壤中能檢測到該特異性條帶,其它土壤中沒有檢測到該特異性條帶;采用二次PCR在棉田土壤中也能夠擴(kuò)增出該特異性條帶,滅菌的土壤中沒有得到此特異性條帶,說明此引物對棉田連作土壤中的AG4-HG.I群菌株能進(jìn)行檢測,但檢測的靈敏度有待進(jìn)一步改善和提

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