中國(guó)北方棉區(qū)棉花立枯病菌融合群鑒定及優(yōu)勢(shì)融合群的特異性檢測(cè)

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1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中國(guó)北方棉區(qū)棉花立枯病菌融合群鑒定及優(yōu)勢(shì)融合群的特異性檢測(cè)姓名：井巖申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：于金鳳20120615山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要棉花立枯病是棉花苗期重要的土傳真菌病害之一，該病害在棉花苗期發(fā)生普遍，尤其是重茬棉田，發(fā)病率高達(dá)50％--60％，直接影響棉花的密植勻株，間接誘發(fā)中后期病害及鈴病的發(fā)生，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國(guó)是世界上的產(chǎn)棉大國(guó)，2004-2008年間棉花均產(chǎn)量達(dá)678．14萬(wàn)噸，占世界原棉年均總產(chǎn)量的27．91％，如何有效的防治棉花立枯病害具有重要意義。以山東、河北和河南為代表的北方棉區(qū)是我

2、國(guó)棉花主產(chǎn)區(qū)之一，常年種植面積和總產(chǎn)量均占全國(guó)的25％以上，棉花立枯病對(duì)該地區(qū)棉花的危害比較嚴(yán)重，本研究對(duì)該地區(qū)棉花立枯病菌的融合群類(lèi)群進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定并對(duì)其優(yōu)勢(shì)融合類(lèi)群AG4一HG．I進(jìn)行了特異性檢測(cè)，主要研究結(jié)果如下：1．從山東、河北和河南三省采集棉花立枯病標(biāo)本和土壤各100余份，使用帶菌土壤溫室中種植棉苗誘發(fā)病菌，從誘導(dǎo)發(fā)病的植株上再分離病菌，以此作為對(duì)一些田間標(biāo)本采集量不足的補(bǔ)充。對(duì)采集到的棉花立枯病病株采用常規(guī)組織分離方法進(jìn)行分離，獲得198個(gè)絲核菌分離物。融合群測(cè)定結(jié)果表明，這些菌株分別屬于多核絲核菌的AG4．HG．I、AG4．HG．IⅡ融合群以及雙核絲核菌的

3、AG．A、AG．F、AG．Fb融合群。其中AG4一HG．I是優(yōu)勢(shì)融合類(lèi)群，占分離菌株總數(shù)的88．38％，其次是AG4一HG—III群，占10．10％，AG．A、AG．F、AG-Fb各僅有l(wèi)株。雙核絲核菌AG-A、AG．F和AG—Fb融合群是國(guó)內(nèi)首次從棉花植株上分離獲得。2．菌株的核相觀察顯示：雙核類(lèi)的絲核菌細(xì)胞核均為2個(gè)；多核類(lèi)的在3個(gè)以上。AG4一HG．I和AG4．HG．III雖然都屬于多核類(lèi)的AG-4融合群，但是兩個(gè)不同亞群的細(xì)胞核數(shù)目存在較大差異：AG4一HG．I亞群菌株細(xì)胞核數(shù)目在亂10個(gè)之間，AG4．HG．HI亞群菌株細(xì)胞核數(shù)目在3～5個(gè)之間。3．利用5．8S

4、rDNA-ITS區(qū)序列分析方法，對(duì)該地區(qū)棉花立枯病菌不同融合群代表菌株的系統(tǒng)演化關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，相同融合群(或亞群)的菌株，序列一致率達(dá)98～100％，而不同融合群(或亞群)菌株之間差異較大。說(shuō)明此基因序列可以對(duì)絲核菌不同融合群或亞群的菌株進(jìn)行有效區(qū)分和鑒定。依據(jù)本研究測(cè)得的16個(gè)代表菌株及13個(gè)源自GenBank且隸屬不同融合群的菌株序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，所有供試菌株被分成三個(gè)大組。第一組為多核類(lèi)絲核菌，包括AG-4融合群的兩個(gè)亞群即AG4．HG．I和AG4．HG．III，這兩個(gè)亞群在進(jìn)化上關(guān)系較近；第二組為兩個(gè)雙核類(lèi)絲核菌中國(guó)北方棉區(qū)棉花立枯病菌

5、融合群鑒定及優(yōu)勢(shì)融合群的特異性檢測(cè)群，為AG—F和AG．Fb兩個(gè)融合群；第三組為雙核類(lèi)的AG—A融合群。進(jìn)一步分析各融合群間的進(jìn)化關(guān)系可以看出，雙核類(lèi)的AG．F和AG．Fb兩個(gè)融合亞群與多核類(lèi)的AG-4融合群親緣關(guān)系相近，而同屬于雙核絲核菌的AG。A與AG-4融合群的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。4．采用麥粒一土壤接種法對(duì)棉花立枯病菌的優(yōu)勢(shì)融合類(lèi)群AG4-HG．I菌株以及分離得到的雙核絲核菌進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果表明，所有的AG4．HG．I群菌株均有較強(qiáng)的致病性，平均病情指數(shù)為55""100，三個(gè)雙核絲核菌對(duì)棉花幼苗的平均病情指數(shù)為12．77。5．用三個(gè)雙核絲核菌針對(duì)棉花立枯病優(yōu)勢(shì)致

6、病群AG4-HG-I進(jìn)行生防效果測(cè)定，用DPS軟件對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行studentt值檢驗(yàn)。結(jié)果表明：三個(gè)雙核絲核菌菌株對(duì)棉花立枯絲核菌AG4．HG．I融合群菌株的生防效果不明顯?！?．利用35個(gè)ISSR引物對(duì)來(lái)自不同寄主上的AG4一HG—I融合群菌株(8個(gè))，以及12個(gè)其他融合群菌株進(jìn)行ISSR分析。從中選取出8個(gè)能對(duì)AG4一HG-I群菌株擴(kuò)增出特異性條帶的引物，利用這些引物對(duì)各融合群代表性菌株進(jìn)行ISSR—PCR擴(kuò)增，將僅對(duì)AG4．HG'I融合群特異的片段進(jìn)行膠回收、測(cè)序，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)出針對(duì)AG4．HG．I的特異性引物對(duì)?！?．用所合成的引物進(jìn)行特異性檢測(cè)結(jié)果表明

7、，引物對(duì)J6．S和J6．A能針對(duì)AG4-HG．I群菌株擴(kuò)增出特異性片段，所擴(kuò)增的片段大小為363bp，屬于其他融合群的絲核菌菌株沒(méi)有擴(kuò)增到任何片段；利用設(shè)計(jì)的引物分別檢測(cè)用AG4一HG．I融合群菌株接種的土壤、采自連作棉田的土壤、采自麥田的土壤、滅菌土壤，一次PCR僅在AG4-HG．I融合群菌株接種的土壤中能檢測(cè)到該特異性條帶，其它土壤中沒(méi)有檢測(cè)到該特異性條帶；采用二次PCR在棉田土壤中也能夠擴(kuò)增出該特異性條帶，滅菌的土壤中沒(méi)有得到此特異性條帶，說(shuō)明此引物對(duì)棉田連作土壤中的AG4-HG．I群菌株能進(jìn)行檢測(cè)，但檢測(cè)的靈敏度有待進(jìn)一步改善和提