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1、中和試驗??物受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生特異性中和抗體，并與相應(yīng)的病毒粒子呈現(xiàn)特異性結(jié)合，因而阻止病毒對敏感細胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和試驗(NeutralizationTest)是以測定病毒的感染力為基礎(chǔ)，以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，來判定免疫血清中和病毒的能力。中和試驗常用的有兩種方法：一種是固定病毒量與等量系列倍比稀釋的血清混合，另一種是固定血清用量與等量系列對數(shù)稀釋(即十倍遞次稀釋)的病毒混合；然后把血清－病毒混合物置適當(dāng)?shù)臈l件下感作一定時間后，接種于敏感細胞、雞胚或動物
2、，測定血清阻止病毒感染宿主的能力及其效價。如果接種血清病毒混合物的宿主與對照(指僅接種病毒的宿主)一樣地出現(xiàn)病變或死亡，說明血清中沒有相應(yīng)的中和抗體。中和反應(yīng)不僅能定性而且能定量，故中和試驗可應(yīng)用于：1.病毒株的種型鑒定：中和試驗具有較高的特異性，利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清，即可測知相應(yīng)血清或病毒的型，所以，中和試驗不但可以定屬而且可以定型。2.測定血清抗體效價：中和抗體出現(xiàn)于病毒感染的較早期，在體內(nèi)的維持時間較長。動物體內(nèi)中和抗體水平的高低，可顯示動物抵抗病毒的能力。3.分析病毒的抗原性。毒素和抗毒
3、素亦可進行中和試驗，其方法與病毒中和試驗基本相同。用組織細胞進行中和試驗，有常量法和微量法兩種，因微量法簡便，結(jié)果易于判定，適于作大批量試驗，所以近來得到了廣泛的應(yīng)用。(一)定血清－稀釋病毒法(病毒中和試驗)1.病毒毒價的測定 毒價單位：衡量病毒毒價(毒力)的單位過去多用最小致死量(MLD)，即經(jīng)規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內(nèi)能致全組試驗動物死亡的最小劑量。但由于劑量的遞增與死亡率遞增不呈線性關(guān)系，在越接近100％死亡時，對劑量的遞增越不敏感。而一般在死亡率越接近50％時，對劑量的變化越敏感，故現(xiàn)
4、多改用半數(shù)致死量(LD50)作為毒價測定單位，即經(jīng)規(guī)定的途徑，以不同的劑量接種試驗動物，在一定時間內(nèi)能致半數(shù)試驗動物死亡的劑量。用雞胚測定時，毒價單位為雞胚半數(shù)致死量(ELD50)或雞胚半數(shù)感染量(EID50)。用細胞培養(yǎng)測定時，用組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)。在測定疫苗的免疫性能時，則用半數(shù)免疫量(IMD50)或半數(shù)保護量(PD50)。(1)LD50的測定(以流行性乙型腦炎病毒為例)。測定方法：將接種病毒，并已發(fā)病瀕死的小鼠，無菌法取腦組織，稱重、加稀釋液充分研磨，配制成10-1懸液，3000r/min離心2
5、0分鐘，取上清液，以10倍遞次稀釋成10-1、10-2、10-3……10-9，每個稀釋度分別接種5只小鼠，每只腦內(nèi)注射0.03ml，逐日觀察記錄各組的死亡數(shù)。表2-24 LD50的計算（接種劑量為0.03ml）病毒稀釋度接種鼠數(shù)活鼠數(shù)死鼠數(shù)積累總計死亡比死亡率(%)活鼠死亡10-450501515/1510010-550501010/1010010-6514155/68310-7541511/61710-85501000/10010-95501500/150LD50的計算：按Reed和Muench氏法計算。高于50%
6、的死亡分數(shù)-50% 83%-50%距離比例=────────────────────=──────=0.5高于50%的死亡百分數(shù)-低于50%的死亡百分數(shù) 83%－17%LD50的對數(shù)=高于50%病毒稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)本例高于50%病毒稀釋度的對數(shù)－6，距離比例為0.5，稱釋系數(shù)的對數(shù)為－1。代入上式：LgLD=-6+0.5×(－1)=－6.5則LD50=10-6.5，0.03ml，即該病毒作10-6.5稀釋，接種0.03ml能使半數(shù)小鼠發(fā)生死亡。注意：稀釋血清法中和試驗，計算TC
7、ID50或LD50，MID50時，計算公式應(yīng)改為：TCID50的對數(shù)=高于50%血清稀釋度的對數(shù)－距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)。如按Karber氏法計算，其公式為：IgLD50（或TCID50）=L+d(S－0.5)L為病毒最低稀釋度的對數(shù)，d為組距，即稀釋系數(shù)，S為死亡比值的和。本例L=－4，d=－1，S=1+1+5/6+1/6=3IgLD50=－4+(－1)×(3－0.5)=－6.5則 LD50=10-6.5，0.03ml注意：用本法計算稀釋血清中和試驗中和效價時，S應(yīng)為保護比值之和。(2)EID50的測
8、定（以新城疫病毒為例） 將新鮮病毒液體10倍遞次稀釋法釋成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀釋度，分別接種9-10日齡雞胚尿囊腔，雞胚必須來自健康母雞，并且沒有新城疫抗體。每只雞胚接種0.2ml，每個稀釋度接種6只雞胚為一組，以石蠟封口，置37-38℃培養(yǎng)，每天照蛋，24h之內(nèi)死亡的雞胚棄掉，24h之后死亡的雞胚置4℃保存。連續(xù)培養(yǎng)
