慢病毒介導(dǎo)rna干擾技術(shù)制備骨橋蛋白基因沉默小鼠模型

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1、學(xué)校代碼：10246學(xué)號：09211220070復(fù)旦大學(xué)碩士（專業(yè)）學(xué)位論文慢病毒介導(dǎo)RNA干擾技術(shù)制備骨橋蛋白基因沉默小鼠模型Osteopontingenesilencingmousemodelmadebylentivirus-mediatedRNAinterferencetechnology【本課題受國家自然科學(xué)基金（No.30801105)資助】院系：華山醫(yī)院專業(yè)：臨床醫(yī)學(xué)（普外)姓名：享n滿導(dǎo)師：陳進(jìn)宏副教授導(dǎo)師小組成員：向陽副教授馬保金教授蔡端教授完成日期:2012年3月12日復(fù)旦大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士論文目錄目錄中英文縮略詞對照表1巾文摘胃2英文摘要4弓IW7第一部分靶向骨

2、橋蛋白基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定11mm11材料與方法11親24艦28誠29參考文獻(xiàn)30第二部分C57小鼠肝臟骨橋蛋白基因沉默動(dòng)物模型的建立31前胃31材料與方法3137討論4042參考文獻(xiàn)42第三部分骨橋蛋白基因沉默C57小鼠肝臟膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的檢測..44"iys44材料與方法44會(huì)課47i寸i倉49辦5152總結(jié)54綜述55附件62致謝63?復(fù)旦大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩L論文中英文縮略詞對照表中英文縮略詞對照表英文縮寫英文名稱中文名稱OPNOsteopontin骨橋蛋白LVLentiviralvector慢病毒載體shRN

3、AShorthairpinRNA短發(fā)夾RNAsiRNASmallinterferenceRNA小RNA干擾BCBlankcontrol空白對照組NCNegativecontrol陰性對照組EGExperimentalgroip實(shí)驗(yàn)組TU/mlTranductionunitesperml每毫升轉(zhuǎn)染單位E.coliEscherichiacoli大腸桿菌AMPAnpicillin氨芐西林LBLuria-Bertani溶菌肉湯MOIMul^licityofinfection感染復(fù)數(shù)GSGenesilencing基因沉默PTGSPosttranscriptionalgenesilencing轉(zhuǎn)錄后基因

4、沉默TGSTransciptionalgenesilencing轉(zhuǎn)錄水平基因沉默3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA3-羥基-3-甲基戊二酰輔HMG-CoARreductase酶A還原酶CYP7alCholesterol7a^)hal-hydroxylase膽固醇7od-羥化酶腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體ABCG5/8ATPbindingcassettetransportG5/G8G5和G8LXRLiverXreceptor肝臟X受體FXRFarnesoidXreceptor法尼醇X受體FoxOlForkheadtranscriptionfector叉頭框轉(zhuǎn)錄因子?復(fù)旦大學(xué)

5、專業(yè)學(xué)位碩士論文中文摘要慢病毒介導(dǎo)RMA干擾技術(shù)制備骨橋蛋白基因沉默小鼠模型中文摘要第一部分靶向骨橋蛋白基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定【摘要】目的構(gòu)建針對骨橋蛋白（Osteopontin，OPN)基因的短發(fā)夾RNA(shorthaiipinRNA,shRNA)序列，合成pSicoR-GFP-shRNA慢病毒重組體，篩選對OPN基因表達(dá)抑制效率最佳的shRNA序列。方法參照OPNGeneBank上的序列設(shè)計(jì)合成shRNA-A，及不針對C57小鼠任何基因的陰性對照序列s_A-NC，參考相關(guān)文獻(xiàn)合成針對骨橋蛋白基因的s_A-B。將合成的shRNA插入到線性化的pSicoR-GFP慢病毒

6、載體中；然后轉(zhuǎn)染EcoliJM109感受態(tài)細(xì)胞，對長出的菌落進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定陽性的克隆再進(jìn)行測序。鑒定序列無誤后，將之與pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.91輔助質(zhì)粒包裝，然后共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒的包裝及滴度測定，控制滴度在lxl09TU/m!以上。用構(gòu)建好的慢病毒感染小鼠肝細(xì)胞，檢測不同s_A序列對OPN基因表達(dá)的抑制效果，篩選最佳s_A序列。結(jié)果經(jīng)RT-PCR禾卩Western-Blot檢測發(fā)現(xiàn):靶向OPN基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞后，序列shRNA-A/B均可有效抑制小鼠肝細(xì)胞OPN基因的表達(dá)，其中s_A-A序列效果最佳（可達(dá)80°/。-9

7、0%)。結(jié)論成功構(gòu)建靶向OPN基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，其轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞后可顯著抑制OPN基因的表達(dá)，這為進(jìn)一步體內(nèi)抑制試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。第二部分C57小鼠肝臟骨橋蛋白基因沉默動(dòng)物模型的建立【摘要】目的將包裝好的慢病毒經(jīng)尾靜脈注射到C57小鼠體內(nèi)，抑制其肝臟骨橋蛋白（Osteopontin，OPN)基因的表達(dá)，建立OPN基因沉默小鼠動(dòng)物模型。方法取30只C57小鼠隨機(jī)平均分為：空白對照組（Blankcon