慢病毒載體介導的小鼠骨髓樹突狀細胞relb基因沉默

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1、慢病毒載體介導的小鼠骨髓樹突狀細胞RelB基因沉默：包杰,王前鄭磊,裘宇容曾方銀,楊春莉,黃憲章【摘要】目的:利用慢病毒載體沉默小鼠骨髓樹突狀細胞(DC)的RelB基因,建立RelB基因低表達的骨髓致耐受DC,為自身免疫病的防治提供新方法。方法:設計小鼠RelB基因干擾的靶序列R5,合成并克隆到慢病毒載體上,與慢病毒的包裝材料在293FT細胞中包裝成病毒顆粒,收集病毒上清,測定病毒滴度,然后包裝慢病毒感染DC,RTPCR和免疫熒光方法檢測,灰度掃描并用軟件分析RelB基因的表達水平,未成熟DC作對照組,選擇T6包裝病毒為RNAi的陰性對照。結果:RTP

2、CR和免疫熒光方法發(fā)現(xiàn)R5病毒感染的DCRelB基因表達水平與未成熟DC基因表達水平接近,低于成熟DC的表達水平（P<0.05）,而實驗對照T6組病毒感染的DC其RelB基因表達水平高于未成熟DC（P<0.05）和R5病毒轉(zhuǎn)染DC組（P<0.05）。結論:小鼠骨髓DC表達的RelB基因被慢病毒載體有效沉默,有望成為DC免疫治療的新載體?！娟P鍵詞】慢病毒載體;樹突狀細胞;RelB基因;基因沉默RelB（avianreticuloendotheliosisviral(vrel)oncogenerelatedB）是核轉(zhuǎn)錄因子NFκB家族成員

3、之一,在樹突狀細胞(dendriticcells,DC)的基因表達調(diào)控中具有重要的作用［1］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)RelB基因的表達水平與DC的成熟狀態(tài)有關,而DC的成熟與否決定了免疫反應的方向［2,3］。因此,DC在感染免疫、自身免疫、移植免疫、腫瘤免疫等免疫介導的疾病中都起著舉足輕重的作用。利用未成熟DC具有誘導機體免疫耐受的特性,構建具有致T細胞免疫耐受的致耐受DC并應用于自身免疫病的免疫治療目前已成為臨床免疫治療的一個熱點。RelB基因作為影響DC發(fā)育成熟的關鍵基因,其表達水平的高低決定了DC的免疫功能。利用可高效、特異下調(diào)目標基因表達的RNAi(R

4、NAinterference,RNAi)技術可實現(xiàn)基因表達沉默。然而,RNAi效應與基因轉(zhuǎn)移效率有密切關系。由于體外培養(yǎng)的骨髓DC對多種脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移效率均極低,嚴格限制了DC在臨床免疫治療中的應用以及DC疫苗的研制［4］。而慢病毒載體,具有既可感染分裂細胞又可感染非分裂細胞,還可整合到宿主細胞的染色體基因組上并具有免疫原性小等優(yōu)點［5］,在基因治療領域中最具發(fā)展前景,為DC的臨床免疫治療帶來了希望。為此,我們利用RelB基因的RNAi慢病毒載體進行了小鼠骨髓DC的RelB基因沉默,構建了RelB基因低水平表達的致耐受DC,為DC治療自身免疫性疾病和

5、預防移植免疫排斥問題作一探討。1材料和方法1.1材料BLOCKiTTMU6RNAiEntryVector試劑盒、LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;RelB的慢病毒干擾片段利用Invitrogen網(wǎng)站上的免費軟件設計由上海生工生物工程有限公司合成;高糖DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;PE標記的大鼠抗小鼠CD86(B72)mAb、PE標記的大鼠抗小鼠IA/IE單克隆抗體(mAb）和PE標記的大鼠抗小鼠CD40mAb均來自BDPharMingen公司;胎牛血清購自杭州四季青公司;質(zhì)粒Midi抽提

6、試劑盒購自Qiagen公司;Polybrene購自Sigma公司;C57BL/6小鼠（7～9周齡,SPF級）由南方醫(yī)科大學動物研究所提供。1.2方法1.2.1小鼠RelB基因RNAi慢病毒載體的構建按參考文獻［6］方法構建小鼠RelB基因RNAi慢病毒載體。簡言之,根據(jù)網(wǎng)站（sirna/）提供的軟件設計合成RelB基因（NM_009046）的特異性干擾片段,序列為R5(RelB)Topstrand:5′CACCGCTGCTCTGTGATGACCAGGTACGAATACCTGGTCATCACAGAGCAG3′;Bottomstrand:5′AAAACT

7、GCTCTGTGATGACCAGGTATTCGTACCTGGTCATCACAGAGCAGC3′,GC含量在35%～55%,在GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST分析其與其他基因的同源性。在干擾片段上游鏈(Topstrand)的5′端加上CACC四個堿基,在下游鏈(BottomStrand)的5′端加上AAAA四個堿基,環(huán)（loop）為CGAA。選擇T6(mock)做為陰性對照,Topstrand:5′CACCGTTCCTTCTGACTAAAGTCCGTCGAAACGGACTTTAGTCAGAAGGAA3′;Bottomstrand5′AAAATTC

8、CTTCTGACTAAAGTCCGTTTCGACGGACTTTA