hiv-1整合酶隨機突變庫的構(gòu)建

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1、塾亙墜!墊僉墮隨扭塞變莊數(shù)煎蕉⑧論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：論文評閱人1：壹墜』塾拯』遁直太堂墮塑堡塑堂醫(yī)評閱人2：隧壑童!塾拯』逝洹太堂墊堂醫(yī)評閱人3：生送鯊』熬拯』逝洹太堂壅堂醫(yī)答辯委員會主席：蔓廛主』塾拯』浙江太堂盛堂瞳委員1：痘里國』塾拯』浙江太堂生金型堂堂瞳委員2：隆叢垣』翌窒旦!逝婆笪絲生塑壓答辯日期：2013／5／31浙江大學(xué)研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫

2、過的研究成果，也不包含為獲得逝姿盤堂或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：1t妙鼉影簽字溉瑚tj年∥月g日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解逝婆盤堂有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交本論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)迸婆本堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位

3、論文作者簽名：t必≤席嘭導(dǎo)師簽名：簽字日期：>DI≥年占月留日簽字日期：為B年6月彥日浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文致謝在論文即將完成之際，我首先要感謝我的導(dǎo)師周亞夫(SamsonA．Chow)教授。教授淵博的專業(yè)知識，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實無華、平易近人的人格魅力對我影響深遠。不僅使我樹立了遠大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、掌握了基本的研究方法，還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。本論文從選題到完成，每一步都是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下完成的，傾注了導(dǎo)師大量的心血。在

4、此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x!我要鄭重感謝我的第二導(dǎo)師藥學(xué)院樓宜嘉教授，她嚴(yán)謹(jǐn)細致、一絲不茍的作風(fēng)一直是我工作、學(xué)習(xí)中的榜樣，她循循善誘的教導(dǎo)和不拘一格的思路給予了我無盡的啟迪。感謝陳愛華、黃佩芳以及沈志成老師在論文編寫、提交以及答辯過程中給予的極大幫助。我要誠摯的感謝葉劍老師和陳歡副研究員在我的學(xué)習(xí)和生活中給予的幫助。你們以淵博的學(xué)識、敏銳的洞察力為我指點迷津、幫助我開拓研究思路，精心點撥、熱忱鼓勵，在此表示深深的感謝。感謝杜悅、蘇錕楷、王丹、嚴(yán)潔萍、沈國芳、王斌、楊立莉等實驗室成員在科研過

5、程中給予我的鼓勵和幫助，謝謝你們，你們對我的關(guān)心和支持是我不斷前進的動力之一，我的研究生生活因為有你們而更加精彩。我要感謝我的父母及家人，你們對我的關(guān)愛讓我深深感受到了生活的美好，你們是我不斷取得進步的永恒動力。最后再一次感謝在我成長過程中關(guān)心、幫助過我的老師、同學(xué)、朋友們!沈?qū)W彬2013年4月于華家池浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要研究背景HIV-1整合酶隨機突變庫的構(gòu)建浙江大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)碩士研究生沈?qū)W彬?qū)烻amsonA．Chow(周亞夫)中文摘要整合酶對于HIVol病毒的復(fù)制至關(guān)重要，同時整合酶在H

6、IV-1生命周期的脫殼與逆轉(zhuǎn)錄過程中均發(fā)揮了重要作用，使得整合酶成為除蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶以外的一個非常具有前景的抗HIV治療的新靶點。目前已有兩個經(jīng)FDA批準(zhǔn)的整合酶抑制劑上市，并且同時還有另外一些整合酶抑制劑已進入臨床試驗階段。然而，有研究團隊發(fā)現(xiàn)，一些含有整合酶突變體的病毒株對于正在進行臨床實驗的或者是已經(jīng)上市的整合酶抑制劑具有耐受性?；瘜W(xué)治療能夠抑制HIV-1病毒的復(fù)制以及AIDS的進一步發(fā)展，然而在此過程中具有藥物耐受性的病毒突變體的出現(xiàn)大大降低了化學(xué)治療的效果，對于治療來說是一個主要的障礙。新藥

7、物的開發(fā)，以及對于具有耐受性的病毒基因型數(shù)據(jù)的分析處理，對于加強治療效果極其重要。然而，要鑒別出導(dǎo)致藥物耐受性的突變需要多年的臨床研究。傳統(tǒng)的體外實驗在獲得可靠的耐藥性數(shù)據(jù)方面存在一定的局限性。為了鑒別出具有藥物耐受性的整合酶突變體，我們引入了轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的堿基替換突變(transposon—directedbase—exchangemutagenesis，TDEM)的方法。該方法能夠制造一個在目的基因上突變位點均勻分布，且每個目的基因的分子含有一至兩個氨基酸隨機突變的一個突變庫。方法我們首先將轉(zhuǎn)座子通過

8、轉(zhuǎn)座反應(yīng)隨機插入到整合酶基因中。轉(zhuǎn)座子的兩端具III浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要有識別并與轉(zhuǎn)座酶結(jié)合的區(qū)域以及NotI內(nèi)切酶識別位點。轉(zhuǎn)座反應(yīng)完成后，通過NotI內(nèi)切酶酶切去除轉(zhuǎn)座子并打開轉(zhuǎn)座子所在的位置，露出因NotI酶切而得到的粘性末端，并將同樣用NotI酶切得到的突變插入片段(MI)與之進行連接。之后通過BsgI與BpmI兩輪酶切，即可去除MI中的多余序列，保留預(yù)先設(shè)計好的三個連續(xù)堿基，這三個堿基便可實現(xiàn)對目的基因中連續(xù)三個堿基的替換