鼠痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法的建立

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1、鼠痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法的建立DevelopmentofLoop-·mediatedisothermalamplificationmethodforthedetectionofEctromeliavires研究生：趙麗娟導(dǎo)師：薛整風(fēng)研究員高誠(chéng)研究員揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心二。一四年六月趙麗娟：鼠痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究鼠痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)法的建立研究生：趙麗娟導(dǎo)師：薛整風(fēng)高誠(chéng)研究員中文摘要環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)是一種新的核酸擴(kuò)增法，在2000年初次出現(xiàn)。主要原理是對(duì)靶

2、基因上人為設(shè)定的六個(gè)獨(dú)立保守區(qū)，根據(jù)這六個(gè)區(qū)設(shè)計(jì)四種特異性引物：包括一對(duì)內(nèi)引物(FIP和BIP)和一對(duì)外引物(F3和B3)。結(jié)合鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件(63℃左右)下保持30～60分鐘。該方法在一定的溫度下經(jīng)過(guò)一步即可完成擴(kuò)增，擴(kuò)增效率極高，可在30～60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增。LAMP方法在實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀測(cè)上也具有顯著優(yōu)勢(shì)。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，而在反應(yīng)中加入鈣黃綠素就能在反應(yīng)結(jié)束看到顏色變化，有黃綠色熒光即代表反應(yīng)發(fā)生了擴(kuò)增，無(wú)需經(jīng)過(guò)電泳鑒定。由于其擴(kuò)增效率高、反應(yīng)

3、簡(jiǎn)單快速、高特異性和反應(yīng)結(jié)果只需肉眼觀察的特點(diǎn)，LAMP法現(xiàn)今已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌等的定性定量檢測(cè)和臨床疾病的診斷。本實(shí)驗(yàn)基于LAMP方法的原理對(duì)鼠痘病毒和仙臺(tái)病毒進(jìn)行檢測(cè)并與傳統(tǒng)PCR方對(duì)比，建立鼠痘病毒和仙臺(tái)病毒的LAMP檢測(cè)方法。根據(jù)鼠痘病毒保守基因設(shè)計(jì)多對(duì)LAMP引物，在實(shí)時(shí)濁度儀的跟蹤監(jiān)測(cè)下篩選出最佳引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)定反應(yīng)條件為63℃、反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，然后進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)和敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)合PCR方法，對(duì)比兩種實(shí)驗(yàn)方法的敏感性優(yōu)劣。結(jié)果顯示引物篩選實(shí)驗(yàn)選出一對(duì)基于Crmd基因設(shè)計(jì)的引物。

4、而在特異性實(shí)驗(yàn)中證明其具有良好的特異性，應(yīng)用這對(duì)引物與小鼠其他病毒反應(yīng)，在設(shè)定時(shí)間內(nèi)均不發(fā)生擴(kuò)增。而鼠痘病毒反應(yīng)迅速，在30分鐘左右即開(kāi)始發(fā)生擴(kuò)增，并在5分鐘之內(nèi)達(dá)到了擴(kuò)增高峰。在敏感性實(shí)驗(yàn)中，把鼠痘病毒DNA十倍稀釋成100至10。6的7個(gè)稀釋度，最后結(jié)果顯示其最小檢出度為5．3x104ng／gL。敏感度比PCR高。為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀測(cè)方法，在鼠痘LAMP檢測(cè)反應(yīng)中加入鈣黃綠素?zé)晒庵甘緞?，?duì)比陰性對(duì)照，結(jié)果顯示發(fā)生擴(kuò)增的反應(yīng)出現(xiàn)了黃綠色熒光，肉眼明顯可見(jiàn)。進(jìn)一步經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后出現(xiàn)連續(xù)性

5、的條帶。在標(biāo)準(zhǔn)法LAMP實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，為了達(dá)到進(jìn)一步加快反應(yīng)速率的效果，在原始LAMP揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文引物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了環(huán)引物。LAMP環(huán)引物是指在啞鈴狀結(jié)構(gòu)5’末端環(huán)狀單鏈區(qū)段(B1到B2區(qū)段、Fl到F2區(qū)段)加入具有與之互補(bǔ)序列的環(huán)狀引物L(fēng)oopPrimerF(LF)、LoopPrimerB(LB)，LF和LB使DNA合成起點(diǎn)變多，因此擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)一步加速。本實(shí)驗(yàn)中鼠痘病毒環(huán)引物只設(shè)計(jì)了一條LB，但在實(shí)驗(yàn)中依然使反應(yīng)速率有一定的提高。而在動(dòng)物的回歸實(shí)驗(yàn)中，選用BALB／c小鼠和BALB／c裸

6、鼠，病毒液濃度做10倍稀釋后分為6組進(jìn)行腹腔注射。采取小鼠血清和各器官組織，用血清做間接ELISA檢測(cè)，提取DNA作為L(zhǎng)AMP實(shí)驗(yàn)的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示LAMP所有樣本均能發(fā)生擴(kuò)增，間接ELISA檢測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)BALB／c小鼠組陽(yáng)性，而裸鼠組陰性。面對(duì)間接ELISA檢測(cè)抗體可能出現(xiàn)的假陽(yáng)性現(xiàn)象，LAMP有著更方便直觀的優(yōu)勢(shì)。關(guān)鍵詞：鼠痘病毒：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增：檢測(cè)趙麗娟：鼠痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的研究DevelopmentofLoop-mediatedisothermalamplificati

7、onmethodforthedetectionofEc仃omeliavirusM．S．Candidate：lijuanZhaoSupervisor：Prof．ZhengfengXueProf．ChengGaoAbstractLoop—mediatedisothermalamplification(LAMP)isanovelnucleicacidamplificationapproachthatwasfirstlyreportedin2000．ThemechanismofLAMPisdesignin

8、gfourspecificprimersaccordingtosixseparateconservativeregionsofthetargetgenes，includingacoupleofinternalprimers(FIPandBIP)andacoupleofexternalprimers(F3andB3)，andcombiningtheBstDNApolymeraseataconstanttemperature(63。C)for30·60min．Atagiventempe