重組胱抑素c的表達(dá)及免疫活性分析

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1、碩士學(xué)位論文重組胱抑素C的表達(dá)及免疫活性分析學(xué)科專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)學(xué)位類型
?科學(xué)學(xué)位□專業(yè)學(xué)位研究生姓名蔣琰導(dǎo)師姓名、職稱吳意教授論文編號(hào)湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室二零一五年五月分類號(hào)密級(jí)學(xué)校代碼10542學(xué)號(hào)201202201513重組胱抑素C的表達(dá)及免疫活性分析ExpressionandimmunocompetenceanalysisofrecombinantcystatinC論文編號(hào)研究生姓名蔣琰指導(dǎo)教師姓名、職稱吳意教授學(xué)科專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)研究方向臨床檢驗(yàn)診斷湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公

2、室二零一五年五月湖南師范大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，致立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中氏經(jīng)注明引用的巧容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中Ｗ明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。＇學(xué)位論文作者簽名２４日：年廠月湖南師范大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書、使用學(xué)位論文的規(guī)定本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留，研究生在校攻讀學(xué)位期間論文王作的知

3、巧產(chǎn)權(quán)單位屬湖南師范大學(xué)。同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)湖南師范大學(xué)可Ｌ義將本學(xué)位論文的全、縮印或掃描部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可Ｌ乂采用影巧等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。幕瓜樂曰作者簽名：＾曰期每喊導(dǎo)師簽養(yǎng)：曰期：年月乃＾裹心巧＾重組胱抑素C的表達(dá)及免疫原性分析摘要目的：1.表達(dá)和純化重組的人胱抑素C(cystatinC,CysC)蛋白；2.鑒定純化的重組CysC蛋白；3.重組CysC蛋白的免疫活性的檢

4、測(cè)。方法：1.根據(jù)GenBank中人CysC功能區(qū)的氨基酸序列，選擇大腸埃希菌喜好的編碼密碼子設(shè)計(jì)合成編碼基因序列，利用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）獲取目的片段，在原核系統(tǒng)中表達(dá)重組人胱抑素C蛋白。2.純化表達(dá)的CysC重組蛋白，用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（間接ELISA法）測(cè)定其反應(yīng)靈敏度及免疫活性。結(jié)果：1.PCR擴(kuò)增CysC后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在250~500bp位置處發(fā)現(xiàn)唯一一條清晰的、大小約為450bp的DNA條帶，相對(duì)分子質(zhì)量大小與CysC基因大小相符，因此可初步確定為目的條帶。構(gòu)建的重組

5、載體pMD18-T-CysC，經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切鑒定后可見兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，經(jīng)過上海生工公司測(cè)序，證明為CysC編碼序列；2.將連接表達(dá)載體的連接物誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE后發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的菌株表達(dá)了一個(gè)大小約為35kD的蛋白，而在對(duì)照組中沒有出現(xiàn)這一I碩士學(xué)位論文條帶，初步說明重組基因在大腸桿菌中獲得了有效表達(dá)；3.WesternBlotting結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白與抗CysC多克隆抗體在大小約為35kD處發(fā)生了反應(yīng)，而陰性對(duì)照則沒有此條帶的出現(xiàn)，進(jìn)一步說明了重組蛋白為CysC蛋白，并

6、且具有良好的免疫反應(yīng)活性；4.間接ELISA結(jié)果顯示，在包被濃度為0.5mg/L時(shí)便產(chǎn)生了陽性值（一般以陰性值的2.1倍設(shè)為臨界值），表明該重組蛋白具有極高的反應(yīng)靈敏度。結(jié)論：1.成功建立了CysC原核表達(dá)系統(tǒng)；2.CysC重組蛋白具有良好的反應(yīng)靈敏度；3.CysC重組蛋白免疫小鼠后血清中IgG效價(jià)已達(dá)制備單克隆抗體的要求，為CysC單克隆抗體的制備打下夯實(shí)的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：CysC；原核表達(dá)；反應(yīng)靈敏度；免疫活性分析II重組胱抑素C的表達(dá)及免疫原性分析ABSTRACTObjective：1.Toexpres

7、sandpurifytherecombinantCysC.2.ToidentifytherecombinationCysC.3.TodetectedtheimmunocompetenceofrecombinantCysC.Method:1.AccordingtohumanCysCfunctionalareassequenceofinGenBank,TheCysCtargetgenesobtainedbyPCRamplificationwhichisselectedEscherichiacolicodonen

8、codetherelevantgenesequencewithtemplate.HumanCystatinCareexpressedinE.coli.2.TherecombinantCysCwaspurified,thenweusetheindirectenzymelinkedimmunosorbentassay(indirectELISA)todetectitssensitivityandimmunogenic