種新可放大重組腺病毒載體純化方法

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1、ANewScalableMethodforthePurificationofRecombinantAdenovirusVectors一種新的可放大的重組腺病毒載體的純化方法摘要：重組腺病毒是各種基因治療的首選載體。但是，這種載體的規(guī)模化發(fā)展的生產(chǎn)和安全性依然是個挑戰(zhàn)。另外，對于這種載體，任何環(huán)節(jié)都必須有充分的證據(jù)來確定其的免疫性和毒性。很多可供選擇的在柱層析的基礎(chǔ)上再用經(jīng)典的CsCl梯度離心純化的方法已經(jīng)形成了，但是第一代的純化過程在潛在的應(yīng)用方面還是有一定的缺陷。本文報道的是一種將兩種樹脂層析柱串聯(lián)的協(xié)同作用的方法來純化腺病毒，分別

2、為anion-exchange（離子交換柱）和PolyFlo柱。PolyFlo柱起到的作用是去除離子交換柱不能除去的宿主細胞蛋白和病毒蛋白。以β-半乳糖苷酶做報告基因的腺病毒載體，H5.CMV-lacZ，過高效液相色譜（HPLC），SDS-PASGE（銀染）,Western分析，電子顯微鏡，VP：IU等分析方法，分別與單純的2×CsCl密度離心純化法和離子交換法進行比較，發(fā)現(xiàn)兩步串聯(lián)法的提純的腺病毒載體純度更高。另外，腺病毒的回收率比2×CsCl離心純化法明顯高，并且遠遠高于第一代的離子交換法。并且整個過程可以再生和放大，每次過柱的進

3、樣量為可達到1015的病毒顆粒。更重要的是，這種方法純化的腺病毒在4℃，-20℃，-75℃，可以保持穩(wěn)定，在多輪的反復(fù)凍融后依然完整。最后，這種方法純化的病毒純度高，易放大，不用離心。本文整體總結(jié)（overviewsummary）重組腺病毒是非常有前景的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，因為其高效的瞬時基因表達能力和高效的轉(zhuǎn)染能力而被用于基因治療。但是，如何生產(chǎn)大量的高純的成規(guī)模的能滿足臨床評估和產(chǎn)量的純化方法確成為一個重要的問題。我們研發(fā)的一種串聯(lián)層析柱的方法能夠提高重組腺病毒的純化，在本文中將從純度、安全性、完整性、功能性（效價）和規(guī)?；确矫孀C明它

4、的純化過程。簡介（introduction）在過去的10年中，重組腺病毒（rAd）載體在基因治療領(lǐng)域引起人們極大7/7的興趣。它在活體內(nèi)具有高效的轉(zhuǎn)基因能力，能夠轉(zhuǎn)染各種野生型細胞，包括需要非常高基因表達能力的造血干（祖）細胞。但是，目前的一些研究表明病毒載體或者表達的基因產(chǎn)物能夠引起對細胞和人體的免疫反應(yīng)，這些會增加毒性和免疫原性。這會削弱重組基因的表達從而降低腺病毒載體的基因治療效果。純化過程中殘余的病毒成份會引起炎癥反應(yīng)，而這些免疫反應(yīng)或許隨后就開始啟動。特別的是，最近的研究證明，當(dāng)把整個腺病毒的一個組份或者游離的蛋白在人體內(nèi)出

5、現(xiàn)時，腺它以一種劑量依賴的方式類似一種佐劑而引起免疫反應(yīng)。所以，近年來在腺病毒領(lǐng)域的發(fā)展主要集中在腺病毒和生產(chǎn)過程的改進，以使毒性最小化和減少免疫反應(yīng)，從而提高轉(zhuǎn)基因的表達效果和穩(wěn)定性。為了改進腺病毒的生產(chǎn)，研發(fā)可放大的純化方法有了新的突破。Huyghe等發(fā)明的方法是首先使用離子交換柱粗純化病毒，然后再用固定化金屬離子層析（IMAC）作為精純化病毒。Blanche等通過單獨或者循環(huán)使用離子交換柱生產(chǎn)高質(zhì)量的腺病毒。這些第一代的柱層析法在純度和產(chǎn)量方面彌補了2×CsCl密度離心純化法的不足。但是作為一種基礎(chǔ)的化學(xué)純化技術(shù)的這種第一代的柱

6、層析法在生產(chǎn)腺病毒的純度方面卻不能與2×CsCl密度離心純化法相媲美甚至不能比它更好。所以在第一代柱層析法的基礎(chǔ)上還需要精純化。在這些關(guān)于純化的文獻中最大規(guī)模病毒顆粒承載量只有為1013，最后產(chǎn)品的回收率也非常低，在Huyghe的方法中大約只有32％，在Blanche的方法只有40％。如此同時，很多出現(xiàn)在國家會議或者公司的專利中的一些純化方法，依然有很多局限性。實驗總是引導(dǎo)改進腺病毒的純化方法。我們發(fā)明了一種串聯(lián)層析柱法，第一步利用離子層析法吸附病毒，第二步再用PolyFlo層析柱來進行精純化。實驗的結(jié)果表明，PolyFlo層析柱能夠

7、區(qū)分細胞蛋白、游離的病毒蛋白碎片與完整的病毒顆粒，從而能夠去除這些在離子交換法(第一步)中不能去除雜質(zhì)。通過不同的病毒收獲方法，從純度、可放大性、再次利用方面對這種串聯(lián)純化法進行評估。一．實驗方法簡譯1.待純化的病毒懸液的制備病毒是E1/E4缺失的rAdH5.CMV-lacZ，用于擴增病毒的是HEK-293細胞，以不同的MOI將病毒加入到細胞中，感染過程持續(xù)2-5天后收獲。由于病毒的擴增方法有不同，病毒的釋放方式有兩種。一種是染毒5天后收集全部液體，處理后用柱層法純化，方法見后。一種是染毒后2-4天收集細胞懸液離心后，細胞沉淀7/7層

8、用PBS洗一次，然后反復(fù)凍融3次，重懸，先用1.2um過濾，再用0.2um過濾，病毒懸液保存在-75℃?zhèn)溆谩?.細胞完全自然破裂的病毒溶解物澄清液的制備病毒溶解樣品首先通過一級粗濾使其變得澄清，然后通過二級過濾吸附而將病