種新可放大重組腺病毒載體純化方法

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1、ANewScalableMethodforthePurificationofRecombinantAdenovirusVectors一種新的可放大的重組腺病毒載體的純化方法摘要：重組腺病毒是各種基因治療的首選載體。但是，這種載體的規(guī)?；l(fā)展的生產(chǎn)和安全性依然是個(gè)挑戰(zhàn)。另外，對(duì)于這種載體，任何環(huán)節(jié)都必須有充分的證據(jù)來(lái)確定其的免疫性和毒性。很多可供選擇的在柱層析的基礎(chǔ)上再用經(jīng)典的CsCl梯度離心純化的方法已經(jīng)形成了，但是第一代的純化過(guò)程在潛在的應(yīng)用方面還是有一定的缺陷。本文報(bào)道的是一種將兩種樹(shù)脂層析柱串聯(lián)的協(xié)同作用的方法來(lái)純化腺病毒，分別

2、為anion-exchange（離子交換柱）和PolyFlo柱。PolyFlo柱起到的作用是去除離子交換柱不能除去的宿主細(xì)胞蛋白和病毒蛋白。以β-半乳糖苷酶做報(bào)告基因的腺病毒載體，H5.CMV-lacZ，過(guò)高效液相色譜（HPLC），SDS-PASGE（銀染）,Western分析，電子顯微鏡，VP：IU等分析方法，分別與單純的2×CsCl密度離心純化法和離子交換法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩步串聯(lián)法的提純的腺病毒載體純度更高。另外，腺病毒的回收率比2×CsCl離心純化法明顯高，并且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第一代的離子交換法。并且整個(gè)過(guò)程可以再生和放大，每次過(guò)柱的進(jìn)

3、樣量為可達(dá)到1015的病毒顆粒。更重要的是，這種方法純化的腺病毒在4℃，-20℃，-75℃，可以保持穩(wěn)定，在多輪的反復(fù)凍融后依然完整。最后，這種方法純化的病毒純度高，易放大，不用離心。本文整體總結(jié)（overviewsummary）重組腺病毒是非常有前景的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，因?yàn)槠涓咝У乃矔r(shí)基因表達(dá)能力和高效的轉(zhuǎn)染能力而被用于基因治療。但是，如何生產(chǎn)大量的高純的成規(guī)模的能滿足臨床評(píng)估和產(chǎn)量的純化方法確成為一個(gè)重要的問(wèn)題。我們研發(fā)的一種串聯(lián)層析柱的方法能夠提高重組腺病毒的純化，在本文中將從純度、安全性、完整性、功能性（效價(jià)）和規(guī)?；确矫孀C明它

4、的純化過(guò)程。簡(jiǎn)介（introduction）在過(guò)去的10年中，重組腺病毒（rAd）載體在基因治療領(lǐng)域引起人們極大7/7的興趣。它在活體內(nèi)具有高效的轉(zhuǎn)基因能力，能夠轉(zhuǎn)染各種野生型細(xì)胞，包括需要非常高基因表達(dá)能力的造血干（祖）細(xì)胞。但是，目前的一些研究表明病毒載體或者表達(dá)的基因產(chǎn)物能夠引起對(duì)細(xì)胞和人體的免疫反應(yīng)，這些會(huì)增加毒性和免疫原性。這會(huì)削弱重組基因的表達(dá)從而降低腺病毒載體的基因治療效果。純化過(guò)程中殘余的病毒成份會(huì)引起炎癥反應(yīng)，而這些免疫反應(yīng)或許隨后就開(kāi)始啟動(dòng)。特別的是，最近的研究證明，當(dāng)把整個(gè)腺病毒的一個(gè)組份或者游離的蛋白在人體內(nèi)出

5、現(xiàn)時(shí)，腺它以一種劑量依賴(lài)的方式類(lèi)似一種佐劑而引起免疫反應(yīng)。所以，近年來(lái)在腺病毒領(lǐng)域的發(fā)展主要集中在腺病毒和生產(chǎn)過(guò)程的改進(jìn)，以使毒性最小化和減少免疫反應(yīng)，從而提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效果和穩(wěn)定性。為了改進(jìn)腺病毒的生產(chǎn)，研發(fā)可放大的純化方法有了新的突破。Huyghe等發(fā)明的方法是首先使用離子交換柱粗純化病毒，然后再用固定化金屬離子層析（IMAC）作為精純化病毒。Blanche等通過(guò)單獨(dú)或者循環(huán)使用離子交換柱生產(chǎn)高質(zhì)量的腺病毒。這些第一代的柱層析法在純度和產(chǎn)量方面彌補(bǔ)了2×CsCl密度離心純化法的不足。但是作為一種基礎(chǔ)的化學(xué)純化技術(shù)的這種第一代的柱

6、層析法在生產(chǎn)腺病毒的純度方面卻不能與2×CsCl密度離心純化法相媲美甚至不能比它更好。所以在第一代柱層析法的基礎(chǔ)上還需要精純化。在這些關(guān)于純化的文獻(xiàn)中最大規(guī)模病毒顆粒承載量只有為1013，最后產(chǎn)品的回收率也非常低，在Huyghe的方法中大約只有32％，在Blanche的方法只有40％。如此同時(shí)，很多出現(xiàn)在國(guó)家會(huì)議或者公司的專(zhuān)利中的一些純化方法，依然有很多局限性。實(shí)驗(yàn)總是引導(dǎo)改進(jìn)腺病毒的純化方法。我們發(fā)明了一種串聯(lián)層析柱法，第一步利用離子層析法吸附病毒，第二步再用PolyFlo層析柱來(lái)進(jìn)行精純化。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，PolyFlo層析柱能夠

7、區(qū)分細(xì)胞蛋白、游離的病毒蛋白碎片與完整的病毒顆粒，從而能夠去除這些在離子交換法(第一步)中不能去除雜質(zhì)。通過(guò)不同的病毒收獲方法，從純度、可放大性、再次利用方面對(duì)這種串聯(lián)純化法進(jìn)行評(píng)估。一．實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)譯1.待純化的病毒懸液的制備病毒是E1/E4缺失的rAdH5.CMV-lacZ，用于擴(kuò)增病毒的是HEK-293細(xì)胞，以不同的MOI將病毒加入到細(xì)胞中，感染過(guò)程持續(xù)2-5天后收獲。由于病毒的擴(kuò)增方法有不同，病毒的釋放方式有兩種。一種是染毒5天后收集全部液體，處理后用柱層法純化，方法見(jiàn)后。一種是染毒后2-4天收集細(xì)胞懸液離心后，細(xì)胞沉淀7/7層

8、用PBS洗一次，然后反復(fù)凍融3次，重懸，先用1.2um過(guò)濾，再用0.2um過(guò)濾，病毒懸液保存在-75℃?zhèn)溆谩?.細(xì)胞完全自然破裂的病毒溶解物澄清液的制備病毒溶解樣品首先通過(guò)一級(jí)粗濾使其變得澄清，然后通過(guò)二級(jí)過(guò)濾吸附而將病