標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

《標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。

1、標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程一目的建立標(biāo)準(zhǔn)菌種確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，以減少菌種污染和生長特性的改變，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。二范圍本規(guī)程適用于質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。三內(nèi)容1.1試驗(yàn)菌株大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]枯草芽抱桿菌(Bac訂lussubtilis)[CMCC(B)63501]白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)64941]黑曲霉(Aspergillusnigcr)[CMCC(F

2、)98003]銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]生泡梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(F)98001]1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株1.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種收藏機(jī)構(gòu)。1.1.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過復(fù)活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。1.1.1.3標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。1.1.2工作菌株1.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株可用于制備毎兩個(gè)刀或定期轉(zhuǎn)種的工作菌株。1.1.2.2工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代(從菌種收藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為

3、第0代)，以防止過度的傳代增加表型變化的風(fēng)險(xiǎn)。因此必要時(shí)，應(yīng)對工作菌株的純度和特性進(jìn)行確認(rèn)。1.2菌種確認(rèn)試驗(yàn)的主要內(nèi)容1.2.1菌種的純度確認(rèn)1.2.1.1純度檢測：是指通過適當(dāng)?shù)姆椒z測菌種是否為純培養(yǎng)物。1.2.1.2試驗(yàn)內(nèi)容①菌落形態(tài)：在特定的培養(yǎng)基上，將待檢測培養(yǎng)物稀釋涂布或平板劃線，適宜培養(yǎng)后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態(tài)的出發(fā)菌株,應(yīng)再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養(yǎng)，檢測是否重復(fù)出現(xiàn)相同特征。①鏡檢特征：對數(shù)生長期的培養(yǎng)物革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)呈現(xiàn)一致性；細(xì)胞形狀、大小、莢膜、芽泡等特征

4、應(yīng)相似。1.2.2菌種的特性確認(rèn)1.2.2.1生化試驗(yàn)：各種微生物具冇各自的獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而在代謝過程中所參與的物質(zhì)分解和合成代謝的產(chǎn)物也不同，這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生化特征。根據(jù)此特征，利用生物化學(xué)方法來鑒定不同的微生物的試驗(yàn)即為微生物的生化試驗(yàn)。1.3菌種的確定方法用無菌接種環(huán)粘取培養(yǎng)物，在相應(yīng)的培養(yǎng)基平板上劃線分離單個(gè)菌落，并在適宜條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察是否具冇典型的菌落形態(tài)，然后挑取單一純菌落，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及菌形。再做生化試驗(yàn)或使用菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)一步鑒定菌種。1.3.1大腸埃希菌的確認(rèn)1.3.1.1菌落形態(tài)1.

5、3.1.1.1取大腸埃希菌新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)35°C培養(yǎng)18?24h后，形成菌膜，管底冇粘液狀沉淀，培養(yǎng)物冇糞臭味。1.3.1.1.2取上述培養(yǎng)物接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上，35°C培養(yǎng)18?24h后，觀察結(jié)果。①曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)平板上菌落形態(tài)呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落屮心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，常有金屬光澤。②麥康凱瓊脂平板上菌落形態(tài)呈鮮桃紅色或微紅色，菌落屮心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤。1.3.1.2革蘭染色、鏡檢1

6、.3.1.2.1革蘭染色①以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取菌落形態(tài)(①、②)的培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片,自然或微溫，再通過火焰2?3次干燥使同定。②滴加結(jié)品紫染液，染色lmin,水洗。③滴加碘液，媒染lmin,水洗，以濾紙吸干余水。④滴加95%乙醇，脫色20?30s,至流出液無色，水洗。⑤滴加沙黃染液，復(fù)染lmin,待干后，鏡檢。1.2.1.2.2染色結(jié)果應(yīng)是：革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色：革蘭陰性菌呈紅色。1.1.1.2.3鏡檢結(jié)果應(yīng)是：兩端鈍圓的短小直桿菌，單個(gè)或成對，革蘭陰性，無芽抱，多有鞭毛，以周身鞭毛運(yùn)動或不運(yùn)動，許多菌株有莢膜和微莢膜。1.

7、3.1.3生化試驗(yàn)1.3.1.3.1靛基質(zhì)試驗(yàn)（I）:取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于蛋白腺水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48h,沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。1.3.1.3.2甲基紅試驗(yàn)（M）:取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖月東水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h,于培養(yǎng)液中加入甲基紅指示液2?3滴（約lml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。1.3.1.3.3乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（V-P）:取菌落形態(tài)（①、②）的培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖月東水培養(yǎng)基屮

8、，培養(yǎng)48±2h,，于2ml培養(yǎng)液屮加入a-蔡酚乙醇試液lml,混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml,充分振搖，在4h（通常在30mi