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《基因工程-7章pcr技術(shù)及其應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、PCR反應(yīng)的模板重組質(zhì)粒DNA基因組DNARNA菌落圖1口腔腺中提取的RNAM:DL2000marker;1:5μLRNA;2:10μLRNA;3:15μLRNA.M12328S18S5S2021/8/134第七章PCR技術(shù)及其應(yīng)用一、PCR技術(shù)原理二、PCR技術(shù)的主要類型三、PCR技術(shù)應(yīng)用2021/8/135㈠PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)一、P
2、CR技術(shù)原理2021/8/136PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物2021/8/137PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈
3、延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTACC3’DNA聚合酶DNA聚合酶2021/8/138PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)明2021/8/139PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana設(shè)
4、想被人們遺忘了……2021/8/1310PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?；驹硎窃谠嚬苤心M細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制。最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行2021/8/1311DNApolermasesforPCR:Thermusaquaticus古細(xì)菌-水生棲熱菌最適生長(zhǎng)溫度70℃，具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性2021/
5、8/1312TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040202021/8/1313引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2021/8/131472℃94℃55℃PCR循環(huán)2021/8/1315PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制DNA變性與復(fù)性聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻19
6、89年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。㈡PCR的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個(gè)PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。2021/8/13162021/8/1317PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95℃)2021/8/1318TargetSeque
7、nceTargetSequencePCR原理示意圖①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93-95℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences2021/8/1319TargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板D
8、NA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；PCRCycle-Step3-At72℃TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomple
