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《柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)生病毒的分子特性及超低溫脫除研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文柑橘黃龍病菌及與其混合發(fā)生病毒的分子特性及超低溫脫除研究姓名:丁芳申請學位級別:博士專業(yè):植物病理學指導教師:王國平;易干軍20060601柑橘黃龍病菌分子第定及0其混合發(fā)生的幾種癇毒分于柃刪技術(shù)研究中文摘要柑橘黃龍病(CitrusHuanglongbing,HLB)是世界性柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害。易與其混合發(fā)生的幾種柑橘病毒病及類似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎葉?。徊≡謩e為Citrustristezavirus(CTV),Citrusexocortisviro耐(CEVd)
2、,Citrustatterleafvirus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV為對象,從生物學角度及分子水平上對其部分特性進行研究;目的是建立上述4種病原的高靈敏度的分子檢測技術(shù)體系;在分子水平上明確其部分分子特性。另外初步探討運用超低溫技術(shù)脫除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及機理。主要獲得結(jié)果如下:1.HLB病菌生物學鑒定及PCR檢測體系優(yōu)化。以長春花和椏柑為指示植物,部分待檢材料表現(xiàn)了明顯HLB癥狀。通過對影響PCR技術(shù)的各個主要因素的調(diào)整,建立了HLB病菌PCR
3、、Semi-NestedPCR及Nested-PCR檢測技術(shù);并對三種方法的檢測靈敏度進行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Semi-NestedPCR及Nested.PCR檢測靈敏度遠高于常規(guī)PCR,是常規(guī)PCR的104倍。運用Nested-PCR技術(shù)在黃皮上檢測出HLB病菌(CandidatusLiberobacterasiaticus),在國內(nèi)外屬于首次報道.2.不同引物檢測HLB病菌靈敏度比較。對基于rplA/rplK,13-operon,16SrDNA和16S/23SrDNA不同基因組序列設(shè)計的5對引物依次為fP
4、400/rP400,fP535/rP535,£A2,rJ5,賊1/rOl2e,fol2/r23S1檢測HLB病菌靈敏度進行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同引物檢測靈敏度不一樣,其檢測靈敏度由高到低依次為:fP400/rP400>fP535/rP535>酗2/訂5>fOll/rOl2c>fOl2/r23S1。3.HLB菌亞洲株系分子鑒定。HLB病菌16srDNA片段RFLP.SSCP分析及基于16SrDNA序列中國柑橘黃龍病菌屬分類地位的確立,分析結(jié)果顯示來自中國7省區(qū)9個代表性的分離物16SrDNA高度保守,全部屬
5、于亞洲菌系(CandidatusLiberobaeterasiaticus)。HLB病菌16S/23SrDNA間區(qū)序列分析及系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果顯示:來自中國7省區(qū)分布在不同的寄主體內(nèi)、導致寄主表現(xiàn)不同癥狀的18個分離物在該區(qū)段沒有發(fā)生顯著變異,各分離物之間的同源性達99%以上,全部與亞洲菌系(CandidatusLiberobacterasiaticus)高度同源,而與非洲菌系(CandidatusLiberobacterafricanum)差異較大。4.HLB病菌Southernblotting檢測。
6、利用a.32P.dC'l-p標記16SrDNA探針進行HLB病菌Dot,blotting檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dot-blotting檢測靈敏度高于常規(guī)PCR而低于Semi-NestedPCR及Nested-PCR,最低檢測下限為30龜總核酸。5.CTV生物學鑒定、RT-PCR檢測技術(shù)的建立及來自不同寄主的21個分離物3’端、5’端分子特性分析。以墨西哥萊檬和甜橙為指示植物,待檢樣品表現(xiàn)典型的CTV致病癥狀。核苷酸序列多重比對分析結(jié)果顯示:21個CTV分離物的5’端和3’端共4個變異區(qū)(A區(qū),F(xiàn)區(qū),CP,P20
7、)存在明顯的差異。A區(qū)的核苷酸序列華中農(nóng)業(yè)大學2006屆博十學位論文相似性最低。為95.92%;F區(qū)的核苷酸序列相似性最高,平均可達98.01%;CP,P20區(qū)的核苷酸序列相似性分別為97.20%,96.39%。21個分離物與GenBank中9個代表性的CTV分離物相應(yīng)區(qū)段的核苷酸序列平均相似性分別為84.21%,96.12%,96.25%,95.48%,說明CTV分離物之間在A,F(xiàn),CP,P204個區(qū)段核苷酸序列存在較大差異。6.CEVd生物學鑒定及RT-PCR檢測技術(shù)建立。以Etrog香櫞為指示植物
8、,待檢樣品表現(xiàn)典型的CEVd致病癥狀。廣東、意大利、重慶中柑所分離物全長eDNA克隆及序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):6個CEVd分離物核苷酸序列相互之間具有明顯的差異,同源性介于95.1%.99.2%之『日J;重慶中柑所分離物ZGS-ZK與意大利分離物Italy.BL核苷酸序列同源性為98.4%,可初步劃歸為相近的株系;廣東分離物XNM.HJ與其它3個分離物核苷酸序列同源性差異在3%左右,因此極有可能為2個不同的株系。7.CTLV生物學鑒定、RT-PC